椎間盤退行性變的生物學治療進展＊

韓小偉綜述，馮 剛審校

（1.川北醫學院組織工程與干細胞研究所，四川南充637000；2.四川省南充市中心醫院／川北醫學院第二臨床醫學院 637000）

椎間盤退行性變可誘發脊柱退行性改變、椎間盤髓核突出、椎管狹窄等疾病，是引起下腰痛的主要原因，因其具有高發病率和高致殘率的特點，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。目前的治療措施主要包括髓核摘除、椎管減壓及退變脊柱節段融合等，但只能在短期內緩解臨床癥狀，其遠期療效并不顯著，且存在并發癥多的缺點[1]。近年來，隨著分子生物學、細胞生物學的深入研究，發現椎間盤細胞數量減少、壓力損傷終板的微骨折、細胞外基質降解增加、炎癥因子的異常表達等均可導致椎間盤的主要成分代謝失衡，從而引發椎間盤退行性變的發生、發展。研究人員以此為基礎，針對退行性變的不同階段，利用基因工程、細胞工程、組織工程手段來恢復退行性變椎間盤細胞數量或重建椎間盤解剖結構和生理功能，從根本上為治療椎間盤退行性變提供了有效策略。

1 椎間盤的結構功能及退變特點

椎間盤屬于免疫豁免、完全封閉、無血管的組織結構，由中央的髓核（NP）、外周的纖維環（AF）及上下軟骨終板（CEP）3部分構成。纖維環呈同心環狀排列，分外層的成纖維細胞層和內層的類軟骨細胞層；髓核細胞生長在髓核凝膠狀基質中，主要含脊索細胞和類軟骨樣細胞，細胞含量較少，但相互之間聯系緊密。髓核細胞分泌的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖為細胞外基質的主要成分，其主要作用是保持正常椎間盤的含水量，保證細胞正常代謝及均勻分布椎間盤應力，從而維持椎間盤一定的形態和靜水壓，有效對抗自身體質量和肌肉運動產生的應力，因此髓核是行使椎間盤功能的關鍵部位。

椎間盤由于完全封閉，其營養代謝途徑主要通過以軟骨終板通路的滲透作用出入椎間盤，此過程受到血管因素、軟骨終板、基質內轉運、細胞因素和機械因素等影響[2]。一旦滲透功能降低，其營養物和代謝物的轉運將受阻，加之局部炎癥因子以及特定基因表達異常等，促使椎間盤細胞生物活性降低，細胞外基質（蛋白聚糖、膠原蛋白等）降解增加，從而引起基質代謝失衡，細胞凋亡加快、間盤水分減少、高度降低，最終導致椎間盤生物力學發生改變。

2 基因工程干預早期椎間盤退行性變

基因治療是通過把一段特定的核酸序列（目的基因）以一定技術或載體轉入靶細胞，以改變細胞核酸成分使其表達特定的細胞因子，從而達到治療或者預防疾病的目的。通過改變細胞遺傳學性狀，使其持續穩定表達基質主要成分，不僅影響靶細胞自身的代謝，還影響周圍細胞的代謝。

椎間盤退行性變的早期，細胞輕度受損，基質分泌能力有所下降。因此早期調控特定細胞因子和抑制炎癥因子的表達，可增加蛋白聚糖和膠原蛋白的合成，維持椎間盤的正常形態及功能或減緩椎間盤退。然而直接將細胞因子和炎癥因子拮抗劑注入椎間盤，往往作用短暫而且價格昂貴，轉基因技術的發展為解決細胞因子和炎癥因子拮抗劑持續作用于椎間盤帶來了便捷之道。

2.1 目的基因的選擇 能夠促使靶細胞穩定表達所需細胞因子的目的基因主要分以下兩類，一類為促進細胞合成代謝途徑的轉化生長因子－β（TGF－β）、胰島素樣生長因子（IGF－1）、骨形態生成蛋白（BMPs）、骨礦化蛋白1（LMP－1）、SOX9基因等；另一類為阻斷細胞外基質降解途徑的金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP－1）、白細胞介素1受體抗體（IL－1Ra）基因等。

Le Maitre等[3]將IL－1與IL－1Ra加入到體外培養的人髓核細胞中，證實IL－1Ra能抑制細胞外基質的降解，增加蛋白聚糖的合成。而IL－1則增加基質蛋白酶3與13的水平，促進蛋白多糖的分解。在研究單個目的基因的作用水平同時，也有研究人員通過進行多基因聯合轉導，來觀察細胞外基質的分泌情況。Kim和Ellman[4]用BMP－7和IGF－1共同作用于牛髓核細胞，發現對照BMP－7或者IGF－1的單一轉染，聯合轉染的蛋白表達量增加更為明顯。但是多種基因的聯合轉導是否真正有效，研究人員之間也存在不同的觀點，作者認為這可能與目的基因選擇和轉入后基因之間的相互作用有一定關系。

2.2 基因治療的載體 應用基因療法來治療椎間盤退行性變必須要有一個基因傳遞載體，能在體內或體外把目的基因導入靶細胞?，F有的載體主要分為病毒載體和非病毒載體。非病毒載體能避免轉染載體的播散和降低宿主對載體的免疫反應，但是它仍受到轉染率不高、基因表達時間短的困擾。而病毒由于能夠侵入細胞并影響轉錄和翻譯，因此最常被用來做為基因傳遞載體。

病毒載體可以分為兩類，一類是可以把基因整合到宿主染色體內而增加其表達時間的載體，如逆轉錄病毒（RV，包括慢病毒載體）；另一類則不把基因整合入宿主細胞的染色體，如腺病毒（AV）、腺相關病毒（AAV）。

以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV－1）為基礎發展起來的慢病毒載體，具有能感染各時相的細胞，并可攜帶較大的基因片段、延長目的基因表達時間等優勢，是近年來基因工程運用較多的病毒載體。Miyazaki等[5]把BMP－2基因整合到慢病毒，然后轉導進兔骨髓間充質干細胞，結果細胞貼附生長的膠原三維支架逐漸消失，注入部位的相鄰橫突間彼此形成骨連接。

腺相關病毒屬微小病毒科家族成員，其復制依賴于其他輔助病毒，如AV、痘苗病毒等。通過對AV和AAV這兩種載體對椎間盤基因治療的安全性作了對比研究，結果發現，腺病毒轉染組大多出現了明顯的臨床、組織學及病理學改變，而腺相關病毒組則未出現明顯的不良反應[6]。

3 細胞移植治療中期椎間盤退行性變

椎間盤退行性變中期，細胞進一步受損，基質分泌能力嚴重下降，基質的降解加快，但病變仍只限制于髓核組織中。此階段單純基因治療并不能有效地干預退變的進展，相比之下細胞移植則不僅能補充椎間盤細胞數量，而且還可以聯合基因工程以提高細胞分泌活性，增加細胞外基質含量。因此，細胞移植是延緩中期椎間盤退變的理想方法?，F有的誘導培養體系為研究者提供了較多類型移植所需的種子細胞，但細胞來源、分化表型、增殖能力、科學倫理等因素又極大地限制了研究者的選擇。

3.1 自體或異體椎間盤細胞移植 椎間盤細胞包括脊索細胞、纖維環細胞、髓核細胞。脊索細胞可以促進髓核細胞增殖分化，對維持髓核內細胞數量及細胞外基質含量起重要作用；正常髓核細胞能合成蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，是構建椎間盤組織工程的理想的種子細胞。Nomura等[7]將兔同種異體的完整髓核和髓核細胞移入吸出髓核導致的椎間盤退行性變模型中，16周后進行組織學觀察和免疫組化檢測，結果顯示，移植完整髓核的椎間盤退行性變最輕，移植髓核細胞的椎間盤次之，未治療的椎間盤退變最嚴重，每組通過CD4和CD5抗體檢查T和B淋巴細胞反應均未發現免疫排斥反應。針對體外培養髓核細胞增殖能力較低且易發生退變，Lwashina等[8]成功建立出人髓核細胞系（HNPSV），并將其植入退變椎間盤，免疫組化分析和形態學觀察發現移植組椎間盤髓核與纖維環結構完整，蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達明顯增高。

3.2 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 主要來源于骨髓、脂肪、臍帶，屬于成體干細胞的分支，現有的研究表明MSCs在椎間盤基質微環境、生物活性物質或椎間盤細胞等共培養條件下均具有向髓核細胞分化的潛能。Yang等[9]將MSCs植入鼠椎間盤退變模型，證實MSCs可以向髓核細胞分化，誘導脊索細胞數量增加，提高蛋白聚糖基因的表達和細胞外基質在髓核部位的聚積。Gaetani等[10]將人脂肪干細胞和髓核細胞在體外藻酸鹽三維培養基中共培養用透射電鏡觀察細胞形態學，免疫熒光法測細胞外基質；結果顯示，脂肪干細胞表達出髓核細胞樣生物活性，產生大量的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，從而能在體外構建出髓核組織。

3.3 誘導多潛能性干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs） iPSCs在形態學、分子學以及分化潛能等方面與胚胎干細胞極為相似，彌補了胚胎干細胞倫理學爭論和異體排異反應的缺陷，以及解決了間充質干細胞增殖和分化能力有限的難題。因其具有胚胎干細胞樣特性，而倍受人們關注，已有學者成功地將iPSCs誘導成神經細胞和心肌細胞，并具有相應功能特性和表達特異性標記[11－12]。

有研究認為軟骨細胞是細胞移植的治療椎間盤退變的最佳種子細胞。Kuh等[13]體外培養軟骨細胞、纖維環細胞、骨髓基質細胞，用重組人骨形態發生蛋白－2（rhBMP－2）添加前后做比較，結果證實軟骨細胞生成的蛋白聚糖量最多。然而軟骨細胞含量稀少，且增殖能力有限，限制了其在研究中的運用。

4 組織工程重建椎間盤

椎間盤退行性變后期，盤內細胞含量極少，分泌功能喪失，組織形態結構也發生改變，纖維環破裂、髓核突出，壓迫脊髓、神經根等組織導致各種嚴重的臨床癥狀。在此階段，基因工程和細胞工程手段均難以恢復椎間盤結構及其生理功能，因此運用組織工程技術重建出具有仿生學性能的椎間盤是我們治療退變后期的關鍵突破口。

目前，組織工程椎間盤的研究主要集中在種子細胞、支架材料、生物活性因子3個方面。除上文提及的種子細胞外，常用的組織工程支架材料可分為天然生物材料、人工合成材料以及復合材料。天然生物材料包括膠原、藻酸鹽、糖胺多糖（glycosaminoglycans，GAGs）[14]、殼聚糖凝膠[15]等；人工 合成材料主要有多聚左旋乳酸（Poly－L－lactic acid，PLLA）[16]、聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）、聚已酸內酯三元醇等；復合材料則是由兩種或兩種以上的不同材料優化組合而成，是椎間盤組織工程的重點研究方向。

4.1 髓核組織工程支架材料研究 去端肽膠原為膠原上抗原決定簇去掉后的一種變性膠原，經處理后免疫排斥性進一步得到了降低了，且在4℃～10℃時呈半液態，在37℃時呈固態，可以按需要塑形。Halloran等[17]將牛尾骨椎間盤髓核細胞接種在去端肽Ⅱ型膠原支架上培養，結果表明該支架能促進細胞生長并穩定的維持細胞表型。Mauth等[18]將纖維蛋白水凝膠與聚氨酯復合以改善支架力學性能和降解速率，提高細胞粘附性能；他們將髓核細胞接種于纖維蛋白凝膠－聚氨酯支架進行體外復合培養，結果發現，髓核細胞的粘附、增殖能力、表型特性得到維持；生化分析進一步表明細胞DNA含量增加，膠原、GAGs等細胞外基質合成增多。

4.2 纖維環組織工程支架材料研究 Shao等[19]將犬纖維環細胞接種于藻酸鹽復合支架，掃描電鏡顯示纖維環細胞生長增殖情況良好、細胞外基質豐富；同時復合支架能緩慢降解，降解產物無細胞毒性。Wan等[20]構建的蘋果酸／聚酯聚合物POM支架，具有更好的機械強度和伸縮性，種植在上面的大鼠纖維環細胞生長良好，同時有Ⅱ型膠原等細胞外基質產生；此外，該研究組成員還成功構建出一種雙相三維彈性支架材料，內相支架由同心狀的聚己酸內酯蘋果酸三醇構成，其外相支架由環狀脫鈣骨基質明膠（BMG）構成，分別模擬內外層纖維環，物理測試結果顯示其拉伸應力接近動物椎間盤纖維環的生理水平[21]。

4.3 軟骨終板組織工程支架材料研究 軟骨終板是供應椎間盤營養的平臺，其發生硬化、鈣化及增厚往往是誘發椎間盤退變的始動因素，然而軟骨終板是一薄層軟骨，構建其完整的支架材料難度很大。Hamilton等[22]在多孔聚磷酸鈣（CPP）表面種植軟骨終板細胞，培養至8周，通過組織學、形態學、力學性能等分析，證實在CPP表面形成了軟骨終板樣組織。Wang和Campbell[23]以聚乙烯醇冷凝膠（PVA－C）模擬天然椎間盤軟組織結構，結果發現PVA－C具有良好的生物力學特性和生物相容性，為構建軟骨終板提供了有效的材料選擇。

5 問題與展望

雖然應用生物學手段治療椎間盤退變的研究結果令人興奮，但是要最終從實驗向臨床治療過渡還需解決諸多問題。（1）目的基因的導入效率低下，通常需要轉染回輸多次才能成功，既損傷了靶細胞的增殖活性又增加了多基因轉導的檢測難度。（2）病毒載體插入或整合到染色體的位置是隨機的，大劑量病毒載體導致的免疫反應以及靶細胞惡性轉化的潛在危險難以排除。（3）現有椎間盤退變的模型大多是通過人為因素制造，和椎間盤本身的退變機制存在一定差異。（4）如果不能解決椎間盤的營養供應，即使前期的工作獲得成功也是沒有任何意義的。（5）在體外培養出的種子細胞團，最終需要植入體內才能完成它的功能，而目前的研究多在于體外培養和動物實驗，雖然能夠表現出一定的生物修復可能性，但植入人體內是否有效發揮作用是一個難以預測的問題。（6）植入的載體支架其仿生學性能未曾有理想的突破，有待進一步解決。（7）在椎間盤退變的病理分級，及其各分級干預的方式，尚無統一標準。

未來研究將會集中在深入了解椎間盤退變的生物學機制、種子細胞的誘導培育、仿生支架的構建及其多個工程手段聯合干預等方面。相信隨著科研工作者的不懈努力，上述問題將會逐一解決，并最終應用于臨床。

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