基于核磁共振的代謝組學在動物營養中的應用

鄒 云 賀建華謝紅兵 楊永生 江碧波 李江長

(湖南農業大學動物科學技術學院，長沙 410128)

代謝組學作為一種高通量、高靈敏度、高精確度的現代分析技術，目前在各個領域的應用已經成為了研究的熱點［1］。后基因組時代的到來驅動著技術的不斷進步，使細胞和整個生物體的功能在分子水平上得到探索和發展。傳統的動物營養研究運用化學分析、消化代謝試驗、平衡試驗、飼養試驗技術等研究營養物質的消化和代謝吸收，這些方法測得的生物學指標比較單一、表觀性強，無法全面反映機體動態營養代謝變化。而代謝組學能測量與生物體有關的整套低分子質量代謝產物、生物體體液或組織的代謝圖譜，可以視為生理或病理狀態的重要指標。這種圖譜對動物細胞調控機制提供了更全面的觀點。因此，代謝組學日益成為整體性研究動物營養的重要分析技術。本文簡要綜述了代謝組學概念、特點和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技術及其在動物營養研究中的應用。

1 代謝組學的概念和特點

1.1 代謝組學概念

在1983年Nicholson首次運用NMR技術對大鼠的全血及血清進行了研究，隨后運用NMR技術分析大鼠的尿液［2－3］，并對NMR的技術提出了展望，于1999年提出了代謝組學的概念［4］。目前，代謝組學被大家所接受的2種定義，一種是metabonomics，Nicholson等［4］將其定義為“定量測定病理生理刺激或基因改變情況下生物系統的動態多參數代謝物變化”;另外一種是metabolomics，最早出現在Fiehn小組的工作中，主要以研究植物生理代謝網絡為目的，其分析技術主要以氣相色譜 － 質譜(GC-MS) 為主［5］。Oliver［6］將其定義為“全面、定量分析生物體系中所有代謝物”。前者多以動物的體液和組織為研究對象，應用NMR技術進行健康與疾病研究，強調的是動態的分析，研究的是生物體在病理生理刺激或基因修飾下其所有代謝物質在不同時間的動態變化規律。后者多以細胞為研究對象，主要應用GC-MS技術，強調的是靜態的分析，是通過定性和定量地分析生物體所有代謝物的組成來研究生物代謝途徑的一種技術。如今兩大流派已經相互交融，研究手段也涵蓋了NMR、GC-MS和液相色譜－質譜等技術。

1.2 代謝組學的特點

代謝產物是基因與環境共同作用的結果，能直接反映生物體的狀態，運用代謝組學技術分析代謝產物，能全面考察外源性物質對生物體產生的整體效應，對于闡明機體復雜變化具有重要意義。與轉錄組學和蛋白質組學相比，代謝組學具有以下優點［7－8］：1)基因表達和蛋白質合成的微小變化會在代謝物上得到放大，從而使檢測更容易;2)代謝組學的技術不需建立全基因組測序及大量表達序列標簽的數據庫;3)代謝物的種類遠小于基因和蛋白質的種類;4)代謝產物在各個生物體系中都是類似的，故代謝組學研究中采用的技術更通用;5)代謝組學的研究標本容易獲得，而且無需進行復雜的預處理。

2 NMR技術

代謝組學研究中常運用的技術有質譜、色譜、NMR、紅外光譜、紫外吸收等，目前，NMR技術已成為代謝組學的主要研究手段，廣泛地應用于各個領域。NMR技術是基于原子核磁性的一種波譜技術，利用其原理可以鑒定化合物結構。由Nicholson等［9］提出的基于NMR的代謝組學研究生物體對外源性物質所引起的病理生理反應，以及對遺傳變異的應答和內源性代謝物的動態變化，通過對生物體液和組織中隨時間改變的代謝物進行檢測、定性、定量和分類，將這些代謝信息與病理生理過程中生物學事件關聯起來。

基于NMR的代謝組學最常用的是氫譜，與傳統的檢測方法相比，NMR的特點是：樣品只需進行簡單預處理甚至不需要處理，樣品用量少，測定時間短，一維譜的測定只需5～10 min，可以同時對所有代謝物進行定量分析，定量測定不需要標樣;沒有損傷性，不會破壞樣品的結構性質，能夠保持樣品的完整;無偏，是一種非選擇性測定技術，對所有化合物的靈敏度是一樣的;可以在接近正常生理條件下試驗，也可在一定溫度和緩沖液范圍內選擇試驗條件;可以進行實時動態檢測，試驗方法靈活多樣;1H、13C、15N、31P的NMR譜都可以應用于代謝組學研究，一維核磁共振氫譜(1HNMR)對含氫化合物都有響應，因為1HNMR的譜峰與樣品中各化合物的氫原子是一一對應的，所測樣品中的每一個氫原子在圖譜中都有其相關的譜峰，圖譜中信號的相對強弱反映樣品中各組分的相對含量;操作方法簡單快速，測量精確，重復性高;測量結果受樣本大小與外觀色澤的影響較小，且不受操作員的技術和判斷所影響。因此，NMR方法很適合研究代謝產物中的復雜成分，通過NMR技術獲得代謝指紋圖，然后通過模式識別方法，提取有關代謝組變化的信息，得出相應的有價值的生物學信息，再對這些生物信息統計分析和研究，了解機體生命活動的代謝過程。但NMR也有其缺陷，主要是靈敏度不夠高，不適合分析同一樣品中濃度相差很大的物質，動態檢測范圍也有一定的局限性。

3 基于NMR的代謝組學在動物營養研究中的應用

隨著后基因時代的到來，技術的不斷進步，動物營養研究也在不斷深入。但仍然面臨著很多問題，盧德勛［10］指出我國動物營養學面臨的任務除了繼續對動物營養需要量和飼料營養價值評定進行深入研究外，還要加強對營養物質調節機制、宏觀層次的營養信息傳遞機制、機體自我營養調控功能以及環境包括應激對機體營養代謝和利用的影響和機制的研究。要解決這些問題，新技術和新方法就成為了關鍵，基于NMR的代謝組學能實現大量重復數據的采集與分析，為養殖提供新的技術支持，為動物營養研究提供新思路，為畜牧業發展提供新的前景。

3.1 基于NMR的代謝組學在動物營養需要量研究中的應用

基于NMR的代謝組學可用于構建基于代謝標識物的營養需要量評估模型，輔助評價動物營養需要量。營養素攝入過多或不足都會引起機體代謝失調，運用基于NMR的代謝組學分析與常量營養素攝入過多或不足相關的代謝產物，從而可以確定常量營養素的適宜需要量。Noguch等［11］表明用代謝組學的方法可以定量測定氨基酸代謝物，可估計攝入適量的氨基酸與安全范圍，可研究某種代謝產物與攝入過量的蛋白質、氨基酸的相關性，以此確定適量安全的氨基酸攝入量。Matsuzaki等［12］對過量攝入亮氨酸的大鼠血漿代謝組學分析表明，尿素和α－酮異已酸可能是氨基酸過量攝入時的標識物。Toue等［13］通過基于NMR代謝組學技術研究蛋氨酸代謝的標識物，揭示了高半胱氨酸是監測蛋氨酸是否過量的良好指標。王小雪［14］利用代謝組學的技術及思路研究家貓對高蛋白質飲食的代謝應答，結果表明NMR研究方法可以用于區分和評價高蛋白質飲食對家貓機體代謝的影響，從而為該動物的蛋白質需要量提供依據。He等［15］研究表明，基于NMR代謝組學技術可用于功能、代謝調節和氨基酸需要量研究，運用代謝組學技術確定飼糧中氨基酸在維持健康和減少疾病的作用方面是非常有前景的。這些試驗充分說明利用基于NMR的代謝組學技術探索動物營養需要量是可行的，相對于常規方法，代謝組學有不可替代的優勢，今后將更廣泛應用于動物營養研究中。

3.2 基于NMR的代謝組學技術用于評價營養物質對機體的影響

基于NMR的代謝組學技術不僅可以研究動物營養需要量，在營養物質對機體影響研究中也可發揮重要作用，主要用于研究營養物質引起的內源性代謝物的變化，更直接反映體內生物化學過程和狀態的變化，從而揭示營養物質對機體影響。Solanky等［16］運用基于 NMR的代謝組學研究發現，表兒茶素(EC)使SD大鼠內源代謝物水平發生明顯變化，EC進入體內影響內源性物質的代謝途徑，代謝能力降低，碳水化合物代謝水平下降，還可能引起肝臟、腎臟功能改變等。Lamers等［17］用代謝組學技術研究了不同劑量的維生素C對豚鼠骨關節炎的作用，收集尿液進行NMR分析，結果表明不同劑量的維生素C對豚鼠骨關節炎的 影 響 有 所 不 同。Martin 等［18］運 用 基于1HNMR的代謝組學方法評估以不同乳制品為主的飼糧對高脂血癥倉鼠早期動脈粥樣硬化的影響，結果表明，食物環境可以起到調節動脈粥樣硬化的作用。此次試驗首次使用代謝組學方法分析由飼糧不同引起的動脈粥樣硬化，揭示了新的潛在疾病的生物標識物。Bertram等［19］利用基于NMR的代謝組學的方法來探索分別以黑麥或小麥為主的富含纖維的飼糧對高膽固醇血癥豬內源性生化效應的影響，揭示了高膽固醇血癥豬攝入高纖維黑麥飼糧后，血漿堿含量增加，并找出了評價血漿堿含量的標識物。He等［20］采用基于NMR的代謝組學技術對飼糧中添加精氨酸對生長豬的影響進行了研究，發現增加飼糧中精氨酸添加量能改變機體脂肪和氨基酸的代謝過程，提高骨骼肌中蛋白質的合成，調節腸道微生物的代謝，顯著提高豬的生長性能。

3.3 基于 NMR的代謝組學研究動物在不同狀態下代謝差異和代謝機制

基于NMR的代謝組學技術還可用于特殊狀態下的代謝差異和代謝機制研究。Duarte等［21］闡述了利用NMR代謝組學方法研究哺乳動物細胞代謝，這些研究包括在細胞特性(例如耐藥性、細胞周期的階段、具體的生長條件和遺傳特征)的差異和在不同干擾條件(例如疾病、藥物暴露和照射)下誘發的變化。Williams等［22］使用1HNMR和高效液相色譜－質譜技術研究老齡化對雄性老鼠尿液中內源性代謝物的影響，發現標識物(包括牛磺酸、肌酐、馬尿酸和相關的氨基酸/脂肪酸)隨著年齡的增加而增加，而檸檬酸和共振產生葡萄糖/肌醇下降，這些技術在研究老鼠老齡化和代謝物關系中發揮了重要作用。Gao等［23］利用1HNMR方法檢測幽門螺旋桿菌感染的沙鼠，試驗結果顯示幽門螺旋桿菌的感染干擾了碳水化合物的代謝，提高α－葡萄糖、β－葡萄糖和順烏頭酸的含量。除了能量代謝改變，定植于沙鼠胃的幽門螺旋桿菌還造成氨基酸代謝的顯著變化，牛磺酸和精氨酸耗竭，而動物尿液中的脯氨酸和谷氨酰胺含量的升高。此外，幽門螺旋桿菌感染改變了腸道菌群的一系列微生物相關的代謝產物，如吲哚酚硫酸鹽和馬尿酸。李民等［24］進行了營養不良大鼠血漿小分子物質代謝組學的研究，結果表明營養不良組大鼠與正常大鼠相比，血漿中肉毒堿和色氨酸含量增加，而甜菜堿、棕櫚酰肉堿、亞麻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸等含量均降低，因此代謝組學可作為營養不良指標的篩選方法。Bertram等［25］選取40頭生豬研究了屠宰前的運動負荷對屠宰時血漿代謝物的影響，結果表明在沒有休息組和對照組之間的血漿代謝圖譜有明顯的差異，這主要可以歸因于屠宰前運動增加血漿乳酸含量，屠宰時的血漿代謝物輪廓與屠宰后1 min肌肉溫度、肌肉系水力高度相關，乳酸被認為是聯系血漿代謝物、pH、溫度和系水力的重要的標記物。劉霞等［26］運用基于1HNMR代謝組學方法分析馬兜鈴酸Ⅰ誘導的雌雄小鼠急性腎毒性，揭示馬兜鈴酸導致急性腎毒的分子機理，即抑制了體內三羧酸循環和能量代謝，破壞了腸道菌群的平衡，引起了腎小管的損傷。Li等［27］通過 NMR技術研究羊在長期道路運輸過程中脂肪酸的代謝變化，揭示了運輸動物經歷腸道代謝、能量代謝、肌肉代謝的變化，還有可能腎臟應答變化，經過48 h運輸的動物表現了更強烈的代謝反應，并且在72 h后才能恢復原來代謝軌跡。Zhang等［28］運用1HNMR結合多元統計技術進行了單側輸尿管梗阻所致腎間質纖維化大鼠的血清樣品的代謝變化研究，結果表明腎間質纖維化組大鼠的代謝圖譜與對照組有很大差異，在單側輸尿管阻塞大鼠中，一些代謝產物如纈氨酸、異亮氨酸、乳酸、3－羥基丁酸、丙氨酸、醋酸、乙酰乙酸、丙酮酸、谷氨酸的水平和時間相關，腎間質纖維化大鼠的脂質代謝和酮體的合成代謝增強，早期纖維化能量代謝轉弱，晚期增強。這些試驗充分說明了基于NMR的代謝組學在研究動物代謝差異和代謝機制方面發揮的重要作用。

3.4 基于NMR的代謝組學在動物食品安全方面的應用

動物食品安全關系著人類的健康，利用NMR的代謝組學研究獸藥在動物體內的殘留。尋找違禁藥相關的生物標志，預測其殘留效應與毒性，將使動物性食品安全的評估工作變得高效而便捷。陳衛江等［29］運用NMR技術對豬肉進行二維成像，從信號成像的質量效果入手，在改變成像參數的情況下分析圖像變化規律，將有利于今后對豬肉進行NMR成像的質量分析的開展，提供了一種研究食品物質性質的方法，有利于肉制品質量的快速定級。Dumas等［30］用代謝組學方法，以區分具有不同生理背景(年齡、性別、品種)不同類固醇治療下奶牛尿中的生物標記。代謝產物中二甲胺、三甲胺－N－氧化物、馬尿酸、肌酸、肌酐、檸檬酸等在代謝圖譜中具有不同特征。這些尿中生物標志物揭示了在氮和能量代謝中的變化。在這項研究中取得的成果，現在可以考慮將代謝組學方法作為一種輔助方法用來檢測濫用藥物的奶牛。Bertram 等［31］對白肌(PSE)肉和黑干(DFD)肉在凍藏過程中的水分活度和分布的變化進行研究，結果表明，NMR對凍藏誘發的肉結構變化以及結構變化所產生的水分遷移非常敏感，隨著冷凍時間的增加，豬肉中自由水的含量也明顯增多，揭示運用代謝組學技術可以檢測豬肉品質。基于NMR的代謝組學在動物食品安全中的應用，遠不止以上所列舉，還可以檢測肉的pH、氧化還原作用、乳制品中微生物含量等。

4 小結

代謝組學在動物營養中的應用處于起步階段，今后，基于NMR的代謝組學技術將在動物營養研究中發揮越來越重要的作用。但是，NMR技術儀器造價昂貴，目前在國內動物營養領域中還沒有普及，此外復雜的數據處理也限制了其發展，因此在今后研究中，要開發代謝組學數據處理軟件，加強代謝組學研究條件的建設，構建動物營養代謝組學研究體系，集中解決這些問題，為其在動物營養領域的研究提供條件。

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