中藥添加劑降低煙氣懸凝物誘導16HBE細胞TNF-α、IL-8及氣道黏液蛋白基因mRNA高表達的實驗研究

魏民巍，鄭賽晶，孟慶乃，金永明，周 昆，胡利民

(1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津市中藥藥理學重點實驗室，天津 300193;2.上海煙草(集團)公司技術中心，上海 200082)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是具有氣流受限特征的呼吸系統常見疾病之一，其發病率和病死率逐年攀升。因出現氣流受限且不完全可逆，呈漸進性進展，導致患者肺功能減退，勞動能力和生活質量下降，嚴重可致殘，甚至死亡[1]。目前普遍認為吸煙是COPD的重要誘因[2]，而慢性氣道炎癥則是其重要的發病機制。有研究認為卷煙能通過誘導氣道上皮細胞產生炎性因子，激活相關通路，繼而誘導氣道黏液蛋白基因(MUC5AC)高表達[3],氣道黏液高分泌可加速患者肺功能下降。為降低吸煙造成的損傷，我們在煙草配方中添加中藥成分提取液，制成卷煙。通過使用煙氣懸凝物刺激人類支氣管上皮細胞16HBE，建立細胞染毒模型，觀察中藥添加劑對卷煙誘導16HBE細胞TNF-α、IL-8及MUC5AC mRNA表達的影響，為中藥添加劑在卷煙中應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RPMI 1640培養液、胎牛血清、青鏈霉素為HyClone產品；0.25% EDTA-胰蛋白酶，Sigma；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒，日本同仁；TNF-α、IL-8 ELISA試劑盒，RD分裝。RNA提取試劑盒，TIANGEN；cDNA合成、RT-PCR試劑盒，Applied Biosystems 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養方法 人類支氣管上皮細胞系16HBE(來源中國醫學科學院腫瘤細胞庫)用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基，在37 ℃，5% CO2培養箱中培養。3～4 d傳代1次，隔天換液。

1.2.2 中藥添加劑卷煙及煙氣懸凝物(CSC)的制備 本實驗所用卷煙由上海煙草(集團)公司提供。中藥添加劑卷煙制法如下：將生藥材回流提取后減壓濃縮，至生藥材與浸膏之比為1∶1，加入浸膏3倍體積量的95%乙醇，24 h后抽濾，取上清液減壓濃縮至稠膏。所得稠膏噴灑在煙絲上，烘干制成卷煙。所用藥材以補中益氣藥為主，輔以清熱潤肺藥。主要包括太子參、杭白芍、枸杞子、丹參、浙貝母等。采用國際主流的煙氣懸凝物染毒細胞[4],以靜電捕集法[5]收集煙氣懸凝物，DMSO洗脫，樣品稀釋至50 mg/mL，分裝至EP管于-80 ℃保存，實驗時用RPMI 1640培養液稀釋至所需濃度。

1.2.3 細胞活力檢測 取指數生長期16HBE細胞，胰酶消化，制成細胞懸液，調整細胞濃度為5×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔培養板內,培養24 h。無血清培養基稀釋CSC至200、100、50、25 μg/mL，每孔200 μL對細胞染毒。12、24 h后棄上清,每孔加100 μL CCK-8溶液(1∶10稀釋),2 h后，多功能讀板機測定在450 nm處的吸光度。計算細胞活力。

1.2.4 PCR法檢測CSC染毒對16HBE細胞TNF-α、IL-8、MUC5AC mRNA表達影響 取指數生長期16HBE細胞，胰酶消化，制成細胞懸液，調整細胞濃度為5×105個/mL。每孔以2 mL細胞懸液接種于12孔板內，培養24 h,待細胞生長單層融合后，予以無血清RPMI 1640培養液饑餓24 h。以不同濃度的CSC對細胞染毒，每個劑量設3個平行孔，每孔終體積1 mL,37 ℃、5%CO2細胞培養箱內培養12、24 h。按RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并計算其濃度，RNA濃度(μg/μL)=OD260讀數×40×稀釋倍數/100。按照cDNA反轉錄試劑盒說明書依次在PCR管中加入反應物，每管10 μL。加入RNA樣品2 μg，用RNase-free water補足反應體系至20 μL。放入PCR儀進行逆轉錄，反應條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min。按PCR試劑盒說明書依次在PCR管中加入反應物。反應條件：預變性95 ℃ 4 min，變性95 ℃ 30 sec，復性58 ℃ 35 sec，延伸70 ℃ 40 sec，30 cycles。應用7 500實時定量PCR儀分析軟件，查看并分析數據，獲得樣品的Ct值，計算得到ΔCt，與對照組比較后，取2-ΔΔCt值進行數據統計。

2 結果

2.1 細胞活力 染毒后細胞活力顯著下降，呈濃度依賴性。含添加劑組細胞活力高于普通煙組，當CSC濃度為100、200 μg/mL時，添加劑組細胞活力較普通煙組顯著升高。

2.2 CSC染毒對細胞TNF-α、IL-8和MUC5AC mRNA表達影響 染毒后，TNF-α、IL-8 mRNA表達增多，呈劑量效應關系。添加劑組低于普通煙組，但無統計學意義。染毒12 h后,MUC5AC mRNA表達增多，呈劑量效應關系。添加劑組顯著低于普通煙組。染毒24 h后,添加劑組低于普通煙組，無統計學意義。

3 討論

煙氣細胞毒性是指在煙氣直接造成細胞死亡的毒性作用，即細胞一次或一段時間內多次接觸煙氣后出現的細胞死亡現象。結果表明，添加劑組細胞存活率高于普通煙組,當CSC劑量大于100 μg/mL時有統計學意義,表明中藥添加劑具有降低CSC細胞毒性的作用。大量研究證實煙氣中的大量自由基不但可以直接破壞細胞內氧化平衡，而且可誘導氣道上皮細胞多種細胞因子表達增多，這些炎癥介質相應基因的表達活性主要是受核轉錄因子(NF-κB),CCAAT/增強了結合蛋白(C/EBP)和激活蛋白復合體-l(AP-l)的調控[6]。香煙煙霧刺激人呼吸道上皮細胞，可誘導白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)[7]和TNF-α的表達增加[8-12]。這些炎癥因子可誘導中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等向氣道內浸潤，放大炎癥反應，造成氣道慢性炎癥和持續損傷。因此比較不同卷煙煙氣懸凝物染毒后細胞TNF-α及IL-8表達對評價中藥添加劑降低卷煙危害作用具有重要意義。此外，香煙還是誘導氣道黏液高分泌的重要因素，可誘導氣道黏液蛋白基因(MUC5AC)高表達[13-14]。氣道黏液高分泌是慢性氣道炎癥的一個重要的病理特征，氣道黏液堵塞是導致發病和死亡的一個主要原因。故將中藥添加劑作為是否能降低氣道黏液蛋白基因表達評價標準之一。實驗結果顯示CSC染毒后細胞TNF-α及IL-8 mRNA表達在一定濃度和時間范圍內呈藥物濃度和時間依賴性表達增加。染毒后TNF-α及IL-8含量及mRNA表達下降，但均無統計學意義。CSC能誘導16HBE細胞MUC5AC mRNA高表達,染毒12 h后，添加劑組顯著低于普通煙組。染毒24 h后，添加劑組低于普通煙組，無統計學意義。此結果表明添加劑可降低氣道黏液蛋白基因表達，其是否能夠減少吸煙所致呼吸道黏液高分泌有待進一步的證實。由于添加劑有效成分經燃燒后轉化率較低，其作用效果亦有待提高。

[1]中華呼吸學會.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)[J].中華呼吸與結核雜志,2007(1):50.

[2]Eisner M D,Anthonisen N,Coultas D,et al.An official American Thoracic Society public policy statement:Novel risk factors and the global burden of chronic obstructive pulmonary disease[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2010,182(5):693-718.

[3]張明周,張明科,歐雪梅,等.HSP70在香煙誘導人類氣道上皮細胞黏液高分泌中的作用[J].四川大學學報(醫學版),2009,40(5):927-933.

[4]Johnson M D,Schilz J,Djordjevic M V,et al.Evaluation of in vitro assays for assessing the toxicity of cigarette smoke and smokeless tobacco[J].Cancer Epidemiology,Biomarkers & Prevention,2009,18(12):3263-3304.

[5]Dube M F,Green C.Methods of collection of smoke foranalytical purposes[J].Recent Adv Tob Sci,1982(8):42-102.

[6]CloutierA,TEar,Blais-Charron B,et al.Differential involvement of NF-κB and MAPkinase pathways inthe Generation of inflammatory cytokines by human neutrophils[J].Leukocyte Biol,2007,81:567-577.

[7]邢瑞婷.香煙煙霧凝集物誘導人支氣管上皮細胞IL-8表達的機制[D].鄭州:鄭州大學,2010.

[8]Moretto N,Facchinetti F,Southworth T,et al.Alpha,beta-Unsaturated aldehydes contained in cigarette smoke elicit IL-8 release in pulmonary cells through mitogen-activated protein kinases[J].American Journal of Physiology-lung Cellular and Molecular Physiology,2009,296(5):839-848.

[9]Oltmanns U,Chung K F,Walters M,et al.cigarette smoke induces IL-8,but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle [J].respiratory research,2005(6):74.

[10]Nakanaga M T,Jay A.Nadel cigarette smoke induces MUC5AC mucin overproduction via tumor necrosis factor-α-converting enzyme in human airway epithelial cells[J].American Journal of Physiology-lung Cellular and Molecular Physiology,2004(287):420-427.

[11]Hellermann G R,Nagy S B,Xiaoyuan Kong,et al.Mechanism of cigarette smoke condensate-induced acute inflammatory response in human bronchial epithelial cells[J].respiratory research,2002(3):22.

[12]LI Chao-jun,Ning Wen,Matthay M A,et al.MAPK pathway mediates EGR-1-HSP70-dependent cigarette smoke-induced chemokine production[J].American Journal of Physiology-lung Cellular and Molecular Physiology,2007,292(5):1297-1303.

[13]Baginski T K,Dabbagh K,Satjawatcharaphong C,et al.Cigarette smoke synergistically enhances respiratory mucin induction by proinflammatory stimuli[J].American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology,2006,35(2):165-174.

[14]Perrais M,Pigny P,Copin M C,et al.Induction of MUC2 and MUC5AC mucins by factors of the epidermal growth factor (EGF) family is mediated by EGF receptor/Ras/Raf/extracellular signal-regulated kinase cascade and Sp1[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277(35):32258-32267.