免疫標記技術在廣州管圓線蟲病診斷中的應用進展

楊毅梅，張霄霄，崔立云，王 菲，曹淑禎

（大理學院基礎醫學院，云南大理 671000）

廣州管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis）是我國陳心陶教授于1933年首次在廣州家鼠及褐家鼠發現的〔1〕，隨后于1945年、1984年分別在臺灣和中國大陸首次報道人感染病例的人獸共患寄生蟲〔2-3〕，迄今全世界報道已確診或疑似感染病例已超過2800例〔4〕。人類因半生食或生食含有三期幼蟲的淡水螺或被三期幼蟲污染的瓜果、蔬菜以及皮膚接觸感染而引起幼蟲移行，導致多器官損傷，如嗜酸性粒細胞增多性脊膜炎或腦膜腦炎（eosinophilic meningitis or meningoencephalitis，EM或EME） 等廣州管圓線蟲病〔5〕，臨床及時診斷對廣州管圓線蟲感染的預防和治療顯得尤為重要。因腦脊液查蟲體檢出率低下已不能滿足臨床病原體診斷需要，近年來免疫診斷技術的快速發展，已發展為臨床實驗室診斷和流行病調查的重要方法之一。本文就近年來廣州管圓線蟲免疫標記技術應用最新進展進行綜述。

1 免疫標記技術概況

免疫標記技術主要通過已知放射核素、酶、熒光素、膠體金或化學發光物等標記物標記抗原或抗體與待測抗體或抗原進行特異反應，通過檢測標記物間接計算出目的抗體或抗原的含量。目前常用的有用于組織切片或其他標本中抗原定位的免疫酶染色試驗（immunoenzyme staining test，IEST）以及液體標本檢測抗原或抗體的酶聯免疫吸附 試 驗 （enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）、酶聯免疫電轉移印跡法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，ELIB）、 間接熒光抗體試驗（ indirect fluorescent antibody test，IFAT）以及新發展的免疫膠體金技術（immune colloidal gold technique，ICG）等都可應用于廣州管圓線蟲感染診斷。

1.1 免疫酶染色試驗 IEST亦稱免疫酶標組織化學法，是采用固相抗原作試驗的一種新技術。常規的IEST可分為直接法和間接法。前者固定抗原直接與酶標抗體結合；后者與前者的區別是酶標二抗而進行酶染色。此試驗敏感性高，近幾十年來國內外將此技術已成功的應用于多種寄生蟲感染檢測和研究中，并取得了較為滿意的結果。

梁浩昆等〔6〕用廣州管圓線蟲成蟲IEST試驗對35份感染2周鼠血清和15份4周鼠血清檢測分析顯示其陽性檢出率分別為80.0%與93.3%，總陽性率達84%。黃緒強和朱佩嫻等〔7-8〕用廣州管圓線蟲感染的大鼠肺組織成蟲、幼齡期成蟲和3期幼蟲制成抗原片，用此法分別檢測20份、39份感染鼠血清和32份健康大鼠血清，其檢測結果表明成蟲抗原片IEST的敏感性高達100%和95%，特異性為100%，而且與馬來絲蟲、豬蛔蟲、曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴感染鼠血清、華支睪吸蟲及日本血吸蟲感染兔血清均無交叉反應。成蟲抗原可在-20℃干燥保存11個月，可知此技術不僅靈敏度高、特異性強、無交叉反應，而且可長期保存使用，可作為臨床輔助診斷，但此技術抗原需石蠟包埋制作，操作麻煩費時，不適用于大規模現場快速檢測。

1.2 酶聯免疫吸附試驗 目前，應用最廣泛的是酶聯免疫吸附試驗，該試驗是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，根據加入底物的顏色反應來判斷是否存在免疫反應。目前主要有以檢測特異抗體的斑點酶聯免疫吸附試驗（Dot-ELISA）、間接ELISA以及檢測大分子抗原的雙抗夾心ELISA用于廣州管圓線蟲診斷。

朱佩嫻等〔9〕采用Dot-ELISA法檢測30只感染廣州管圓線蟲SD大鼠血清的陽性率為100%，與日本血吸蟲和曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴感染大鼠血清無交叉反應，但只在豬蛔蟲粗抗原免疫大鼠血清中出現陽性反應。Tomanakan K等〔10〕用同樣技術檢測30例隱球菌腦膜炎患者、22例細菌性腦膜炎患者、32例嗜酸性粒細胞性腦脊膜炎患者、18例其它寄生蟲感染患者和30例健康人血清，只有在嗜酸性粒細胞性腦脊膜炎患者中檢出陽性結果，靈敏度為81.3%，其它都為陰性。Ramírez PM等〔11〕報道廣州管圓線蟲蟲卵抗原包被的間接ELISA的敏感性和特異性分別為90.5%和87.0%，但存在交叉反應現象。梁韶暉〔12〕等利用雙抗夾心ELISA法檢測廣州管圓線蟲小鼠循環抗原（circulating antigen，CAg）和人血清感染廣州管圓線蟲CAg，其靈敏度分別為87.2%和86.36%，特異性均為100%。Chen〔13〕等采用同樣的方法檢測感染廣州管圓線蟲大鼠、小鼠以及人血清廣州管圓線蟲CAg的靈敏度和特異度均為100%，而且與日本血吸蟲等9種寄生蟲無交叉反應。Chye〔14〕等制備分子質量單位為204 ku的廣州管圓線蟲5期幼蟲抗原，利用雙抗夾心ELISA法檢測42例患有嗜酸性粒細胞增多性脊膜炎或腦膜腦炎的病人血清及腦脊液；在腦脊液查見蟲體的病人中血清陽性率為95%（19/20），腦脊液陽性率為85%（17/20）；在未查見蟲體的病人中血清陽性率為86.4%（19/22），腦脊液陽性率為81.8%（18/22），40例血清對照組中只有1例陽性，腦脊液對照組均為陰性。

上述研究表明，ELISA方法檢測廣州管圓線蟲靈敏度高，特異性強，完全適用于臨床和科研中廣州管圓線蟲感染的檢測，其中Dot-ELISA法可在同一條固相膜上包被多種病原體抗原，可以同時獲得廣州管圓線蟲和其他病原體檢測結果，但操作麻煩，不利于流行病學調查。間接ELISA該法只需一種酶標二抗就可以檢測多種抗體，但易受到標本其他物質干擾產生假陽性結果。而廣州管圓線蟲雙抗夾心ELISA法則呈現出高特異性、高敏感性及重復性等優點，而且無交叉反應，不僅適合于早期臨床診斷而且可以應用廣州管圓線蟲的流行病學篩查。

1.3 酶聯免疫電轉移印跡法 ELIB試驗是將免疫轉印技術與酶標技術兩種技術結合應用于分析待檢樣品復雜抗原成分的新技術，其可更精細分析廣州管圓線蟲抗原復雜成分，在廣州管圓線蟲科研中應用廣泛。

岳莉莉等〔15〕用此技術對廣州管圓線蟲雄性和雌性成蟲蛋白質分析顯示雄蟲只有30條區帶，雌蟲存在40條區帶蛋白，約有20種蛋白質具有較強的免疫原性。李華等〔16〕應用此技術對各期廣州管圓線蟲蟲體蛋白分析表明發育各期的蟲體蛋白質譜基本一致，無本質區別。因此科研當中不能根據蟲體蛋白分析判斷蟲體發育階段，但可根據單一抗原的免疫反應特性來判斷蟲體發育情況。由此可知此技術具有高蛋白分辨能力、檢測穩定性高等特性，可廣泛應用于廣州管圓線蟲科研中，與日本血吸蟲、曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴抗原免疫以及絲蟲等無交叉反應，但僅與豬蛔蟲抗原免疫和旋毛蟲抗原存在交叉反應〔16-17〕，而其試驗成本以及操作復雜等因素不利于臨床實驗室診斷廣州管圓線蟲的應用，更不利于流行病學和現場快速診斷。

1.4 免疫熒光技術 免疫熒光技術是異硫氰酸熒光素、羅丹明等熒光素標記抗體或抗原，與待檢樣本反應，在熒光顯微鏡下檢測標本中抗原或抗體的方法。其主要包括熒光抗體染色和熒光免疫測定兩種技術，其中應用于廣州管圓線蟲抗原定位和檢測的主要是IFAT方法。

潘長旺等〔18〕運用IFAT和免疫金銀染色試驗（immunogold silver staining，IGSS） 對廣州管圓線蟲的抗原定位進行研究，IFAT的特異性熒光在廣州管圓線蟲的腸管壁、子宮內蟲卵的卵細胞、卵巢和皮層均有顯示，而IGSS只在腸管壁有顯示，對照試驗均為陰性，表明蟲體的腸管壁是主要抗原定位器官，為比較兩種方法的準確性，以大鼠旋毛蟲和肺吸蟲抗體陽性血清作對照，用IFAT對廣州管圓線蟲做交叉試驗，結果均未發現皮層有明顯熒光，說明IFAT特異性較好。李小龍等〔19〕將此方法檢測疑患廣州管圓線蟲病人血清和健康人群血清顯示其檢測靈敏性為83%，特異性為100%。而Sandi EA等〔20〕報道此試驗檢測廣州管圓線蟲感染的敏感性和特異性分別為93.7%和84.6%，只與糞類圓線蟲呈現交叉反應現象。可知此技術不僅可應用于廣州管圓線蟲科研當中，而且敏感性高，特異性強，也可以應用于臨床廣州管圓線蟲感染的診斷，但需要熒光顯微鏡觀察，此技術不適用于廣州管圓線蟲流行病學研究和現場快速診斷分析。

1.5 免疫膠體金金標法 ICG是以膠體金為標記物發展起來的固相標記免疫測定技術。此技術快捷、經濟、簡易操作等優點在臨床和現場快速診斷應用廣泛。目前應用于廣州管圓線蟲檢測主要有斑點金免疫滲濾試驗（dot immunogold filtration assay，DIGFA）、膠體金免疫層析試驗（gold immunochromatography assay，GICA）等試驗。

曾肖芃等〔21〕包被廣州管圓線蟲成蟲抗原構建廣州管圓線蟲DIGFA法檢測感染鼠血清的陽性率高達96.0%（48/50），健康鼠血清全為陰性，與ELISA法符合率高達96.7%，與蟯蟲和絳蟲感染鼠血清無交叉反應，但與糞類圓線蟲交叉反應率為5.6%。干小仙等〔22〕采用包被廣州管圓線蟲成蟲可溶性抗原的DIGFA法分別檢測患者和健康人群血清，其檢測敏感性為90.5%，與ELISA檢測符合率>90%，與血吸蟲病和旋毛蟲病交叉反應率分別為3.3%和26.7%，但與并殖吸蟲病、囊尾蚴病、華支睪吸蟲病和肺結核不存在交叉反應。黃達娜等〔23〕采用包被12D5和21B7單抗點GICA法和雙抗（12D5和21B7）夾心ELISA法同時快速檢測感染廣州管圓線蟲大鼠和患者血清CAg，檢出率均為100%，與日本血吸蟲、肝吸蟲、肺吸蟲、旋毛蟲、蛔蟲和包蟲病血清均無交叉反應。Chen等〔24〕使用廣州管圓線蟲GICA法成功地對來自南方五省和北京市流行疫區的1730例血清樣本進行流行病學調查分析表明長期從事水產和螺螄類養殖的男性人群感染廣州管圓線蟲病的幾率相對普通人群風險更高。

免疫膠體金技術是近幾年發展的新型快速診斷技術，具有高敏感性和特異性強，操作簡單等優點，其檢測效能與ELISA相當，在無定量需求情況下，可用此技術替代ELISA檢測廣州管圓線蟲感染，但因包被廣州管圓線蟲抗原的不同，其檢測特異性還有待提高。但此技術無需特殊設備儀器，簡單、快捷、易操作，特別適合于臨床中小醫院廣州管圓線蟲病感染檢測和流行病學調查以及現場快速檢測分析。

2 結語

廣州管圓線蟲是寄生性變溫動物，其生長發育易受中末宿主和環境溫度的影響，近些年全球變暖，其發病疫源地也隨之擴大，特別是人們飲食習慣的改變導致廣州管圓線蟲病患者呈逐年上升趨勢。提高廣州管圓線蟲的科研水平和臨床診斷能力對預防廣州管圓線蟲病的傳播、早期診斷和預后療效觀察顯得尤為重要。近些年來新型標記物、反應體系改進、單克隆抗體以及包被技術提高和新材料的應用，免疫診斷技術已發展為廣州管圓線蟲輔助診斷方法。但抗原抗體存在失活、反應親和力和特異性不高等原因，導致出現假陽性、假陰性和交叉反應等缺點，但相信隨著基因工程特異性抗原的應用，不斷改進免疫反應體系和條件，高效標記和包被技術的發展應用，開發出更簡便、經濟、快速并能診斷區分現癥感染和既往感染、評估感染度以及療效觀察的理想免疫學標記技術無疑對廣州管圓線蟲的預防和診斷治療具有重要意義。

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