HPLC法同時測定人血漿中舍曲林與氯氮平的濃度Δ

劉偉忠，陳清霞，溫預關，王廣發（.廣州市腦科醫院國家藥品臨床研究基地，廣州50370；.中山大學附屬第二醫院藥學部，廣州 500；3.南方醫科大學藥學院，廣州 5050）

舍曲林（Sertraline）是一種選擇性的5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑（SSRI），該藥通過對突觸前膜5-HT再攝取泵的強力抑制，促進5-HT能神經遞質的傳遞；與傳統的三環類抗抑郁藥不同，舍曲林在中樞的作用部位具有高度選擇性，對中樞的各種受體如乙酰膽堿受體、腎上腺素受體、組胺H受體均無阻滯作用，常用于強迫癥與抑郁癥的治療[1]。氯氮平（Clozapine）是一種非經典抗精神病藥，其鎮靜作用強，具有強大的抗精神病效應；對精神病陽性和陰性癥狀均有良好療效，較少引起錐體外系反應（EPS）[2]。臨床上，舍曲林與氯氮平常聯合用于抑郁癥、強迫癥及精神分裂癥陰性癥狀的治療[3～5]，特別對伴有陰性精神分裂的抑郁癥患者療效顯著。這是因為精神分裂癥陽性癥狀與中腦邊緣系統多巴胺（DA）活性增強有關，而陰性癥狀與額前葉DA活性下降及5-HT機制有關。氯氮平具有拮抗5-HT受體作用，從而增強額葉皮質及紋狀體DA活性，改善精神分裂癥陰性癥狀；而舍曲林是SSRI類藥中已知對細胞色素氧化酶影響最小的藥物之一，藥物相互作用很少，安全性高，是唯一對DA再攝取產生顯著的抑制作用而增強大腦額葉皮質DA功能的藥物，具有抗焦慮、抗抑郁雙重作用，能增加患者的思維活性，可改善精神分裂癥患者的認知功能，從而緩解陰性癥狀[5]。這2種藥物血藥濃度的單獨測定國內、外均有報道[6～8]，但這些方法儀器成本太高，臨床普及受到限制。本試驗以建立了一種簡單、快速的高效液相色譜（HPLC）法，同時測定人血漿中舍曲林與氯氮平的濃度。

1 材料

1.1 儀器

1100 HPLC儀，包括G1322A在線脫氣機、G1315B二極管陣列紫外檢測器（DAD）、G1313A自動進樣器、G1311A自動調配器、G1316A可調柱溫恒溫箱和Agilent色譜化學工作站（美國Agilent公司）；XW-80A渦旋混合器（上海醫科大學儀器廠）；BSA124S-CW電子分析天平（瑞士Sartorius公司）；MIKO12-24高速離心機（美國Hettich公司）；MILLI-Q超純水儀（法國Millipore公司）。

1.2 試藥

舍曲林對照品（輝瑞制藥有限公司，批號:95872017，含量＞99%）；氯氮平對照品（廣東彼迪藥業有限公司，批號:20100306，含量＞99%）；內標:地西泮（廣東省藥品檢驗所，批號:20060508，含量＞99%）；醋酸銨（廣東臺山粵僑試劑有限公司，批號:20090125，含量＞98%）；提取劑:乙酸乙酯與二氯甲烷（廣州化學試劑廠，含量＞99%）；乙腈與甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:美國迪馬公司的DiamonsilTMC18反相柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:30 mmol·L－1醋酸銨-乙腈（22∶78）；流速:1.0 mL·min－1；柱溫:40 ℃；檢測波長:210 nm；靈敏度為0.01 AUFS。

2.2 血漿樣品處理

取1.0 mL含舍曲林與氯氮平的血漿至10 mL具塞玻璃錐形離心管內，精確加入1.0 mg·L－1內標液20μL，振蕩數秒。再加提取劑乙酸乙酯-二氯甲烷（80∶20）4.0 mL，密塞，渦旋振蕩3 min，于6 000 r·min－1的離心機內離心4 min。吸取上清液至5 mL具塞玻璃錐形離心管中，然后置于真空干燥箱內，40℃干燥至干。進樣前加甲醇100μL快速振蕩數秒溶解殘渣，吸取15μL進樣。

2.3 色譜分離情況

在本試驗條件下，空白血漿、舍曲林與氯氮平對照品+空白血漿+內標以及精神病患者同服舍曲林與氯氮平后的血漿樣品，經本法測定，得到的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

由圖1可知，內標物、舍曲林和氯氮平的色譜峰能完全分離，無明顯的內生雜質峰干擾，可見本方法具有較高的專屬性。內標物、氯氮平和舍曲林保留時間為4.46、5.03和5.84 min。

2.4 標準曲線的制備

在7個10 mL具塞錐形離心管中分別加入不同濃度、相同體積（20μL）的舍曲林與氯氮平對照品溶液，真空抽干溶劑后，再加空白血漿1.0 mL，振蕩數秒，使舍曲林血漿濃度分別相當于20.0、40.0、80.0、160.0、240.0、480.0、600.0 μg·L－1，氯氮平血漿濃度分別相當于 50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1 000.0 μg·L－1，然后按“2.2”項下方法處理后，經HPLC分析，測得藥物峰面積Ai、內標峰面積As，以Ai/As的值（X）為橫坐標，以血漿樣品所對應各點藥物濃度（Y）為縱坐標繪制標準曲線。經加權（權重W＝1/X2）最小二乘法進行線性回歸，分別得舍曲林、氯氮平曲線方程為:Y＝72.527X+1.39（r＝0.998 6）、Y＝43.758X+2.35（r＝0.999 3）。結果表明，舍曲林、氯氮平血藥濃度分別在20.0～600.0 μg·L－1、50.0～1000.0 μg·L－1范圍內線性關系良好。當信躁比（S/N）＝3時，舍曲林與氯氮平的檢測限可達到10.0 μg·L－1。

2.5 回收率及精密度試驗[10]

按“2.4”項下方法取舍曲林低、中、高濃度（40.0、160.0、480.0 μg·L－1）和氯氮平低、中、高濃度（100.0、400.0、800.0 μg·L－1）含藥血漿樣品，按“2.2”項下方法處理，經色譜分析，以峰面積比較，計算回收率:舍曲林與氯氮平低、中、高濃度的峰面積與標準曲線所對應點的峰面積之比為相對回收率；而與相同濃度未經提取獲得的色譜峰面積之比為提取回收率。結果顯示，相對回收率均＞95%，提取回收率均＞70%。同時，在同日內重復5次和1周內重復5次測定其濃度，計算日內、日間RSD，結果表明，該方法符合生物樣品分析要求。回收率及精密度試驗結果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結果（±s ）Tab 1 Results of recovery and precision test（s±s ）

表1 回收率及精密度試驗結果（±s ）Tab 1 Results of recovery and precision test（s±s ）

藥物舍曲林氯氮平加入量/μg·L-1 40.0 160.0 480.0 100.0 400.0 800.0日內精密度（n＝5）實測濃度/μg·L-1 40.3 158.2 476.3 101.3 397.4 796.6 RSD/%7.63 6.21 5.78 7.41 6.85 4.47日間精密度（n＝5）實測濃度/μg·L-1 40.6 157.8 476.7 100.7 396.1794.6 RSD/%9.52 7.37 5.52 8.14 7.76 5.85相對回收率（n＝5）回收率/%100.30 97.49 96.95 101.50 98.16 97.74 RSD/%7.32 6.71 5.26 7.59 6.36 4.92提取回收率（n＝5）回收率/%75.12 73.75 71.65 77.56 74.35 72.19 RSD/%7.12 6.87 4.31 7.65 5.72 4.46

2.6 樣品穩定性試驗

按“2.4”項下方法分別配制舍曲林低、中、高濃度（40.0、160.0、480.0 μg·L－1）和氯氮平低、中、高濃度（100.0、400.0、800.0μg·L－1）的3組18個樣品（雙樣），各于室溫（25～28℃）放置0、12 h和－20℃凍存1、14 d以及－20℃凍存1、3周后分別進行色譜測定。結果顯示，RSD均＜10%，凍存樣品未發生藥物降解。

2.7 樣品的質量控制

按“2.4”項下方法分別配制舍曲林低、中、高濃度（40.0、160.0、480.0 μg·L－1）和氯氮平低、中、高濃度（100.0、400.0、800.0 μg·L－1）36個血漿樣品，置于－20 ℃冰箱凍存備用，作為質控樣品。每次檢測血樣時，同時檢測質控樣品，如果相對回收率均落在85%～115%（低濃度在80%～120%）之內，即可認為儀器檢測正常，否則須檢查整個操作過程及儀器原因。

3 討論

舍曲林與氯氮平結構中都有苯環，紫外吸收明顯。吸取舍曲林與氯氮平對照品溶液在190～400 nm波長范圍內進行紫外掃描，發現舍曲林在210 nm波長處有一最大吸收峰，氯氮平在210、229、256 nm波長處均有最大吸收峰，因此本試驗選擇210 nm為檢測波長。舍曲林與氯氮平血藥濃度單獨檢測方法國內、外已有報道[6～9]，相比之下，本試驗采用HPLC法同時測定人血漿中舍曲林與氯氮平濃度的方法，具有操作簡單、成本低廉、專屬性好等特點，提取回收率＞70%，相對回收率接近100%，日內、日間RSD均＜10%，符合臨床藥動學試驗指導原則關于生物樣品分析方法的基本要求，結果可靠。

在本試驗的過程中，曾用30 mmol·L－1醋酸銨-甲醇（24∶76）作流動相，也能使內標物和舍曲林、氯氮平有較好分離，但血漿中內源性物質干擾嚴重，很易引起基線漂移；后改用30 mmol·L－1醋酸銨-乙腈（22∶78）時，色譜峰很理想。另外在本試驗過程中曾分別使用乙醚、正己烷、乙酸乙酯和三氯甲烷為提取劑，提取率都達不到要求，而且單采用乙酸乙酯提取時血漿容易出現乳化現象。后改用乙酸乙酯-二氯甲烷（80∶20）作提取劑，提取率較理想，且避免了血漿乳化；采用此混合提取劑一次提取，后用甲醇定容進行紫外色譜分析，所取血漿僅為1.0 mL，進樣量15μL便達到試驗要求，既提高了靈敏度又減少了樣品雜質，保證色譜柱能進行大量樣品的連續分析。

在臨床精神科，對于難治性精神分裂癥或情感障礙，單一用藥往往很難控制患者癥狀，而采用聯合用藥，治療效果顯著。由于抗精神病藥治療窗相對較窄，毒副作用大，因此對其進行治療藥物監測（TDM），尋找療效最佳、副反應最輕的適宜血藥濃度，具有積極的臨床意義。同時，雖然氯氮平血藥濃度與患者臨床用藥劑量呈顯著正相關，但從病例資料看也存在一定程度上的個體差異，單一患者的治療劑量不一定適用于所有患者，應密切監控其血藥濃度，做到用藥劑量個體化[2]。舍曲林與氯氮平單個藥物的TDM國內、外已有報道[6～9]，相比之下，本試驗建立的同時測定2種藥物的HPLC法，并應用于臨床監測，實用性更優越。

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