神經導管聯合自體變性肌橋修復大鼠周圍神經缺損的實驗研究

李 政 周 明

神經導管聯合自體變性肌橋修復大鼠周圍神經缺損的實驗研究

李 政 周 明

目的探討PLGA神經導管聯合化學萃取的自體骨骼肌肌橋，修復大鼠坐骨神經缺損的可能性。方法SD大鼠45只，建立大鼠左側坐骨神經缺損模型。隨機分為3組，分別采用自體神經（A組）、PLGA神經導管（B組）和PLGA神經導管聯合化學萃取自體骨骼肌肌橋（C組），來修復神經缺損。術后通過大體觀察、坐骨神經功能指數測定、腓腸肌濕質量恢復率測定、組織學觀察和圖像分析對比等，檢測神經缺損修復情況。結果神經導管聯合化學萃取自體骨骼肌肌橋能促進坐骨神經再生，各項指標均優于單純神經導管移植，但是效果略差于自體神經移植。結論PLGA神經導管聯合化學萃取自體骨骼肌肌橋，對大鼠坐骨神經缺損具有良好的橋梁作用和促神經生長的作用。

神經再生神經導管聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物變性骨骼肌肌橋

周圍神經長段缺損是臨床較棘手的問題，目前的最佳修復方法依舊是自體神經移植，但存在諸多缺點。多年來人們一直在嘗試應用人工神經來修復周圍神經的長段缺損，但尚無理想結果。

理想的人工神經應是一種特定的三維結構支架的神經導管，可接納再生軸突的長入，對軸突起機械引導作用；導管材料應具有良好的組織相容性、適當的孔徑和孔隙率、可降解性及降解速率可調控性，并具備一定的機械強度和柔韌性。

本實驗研究采用可降解的神經導管，聯合化學萃取自體肌肉，制作肌肉基底膜管以促進大鼠坐骨神經的再生，為修復周圍神經缺損提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Triton X-100（P ackard，USA）；D eoxycholate鈉鹽（Sigma，USA）；聚乳酸和聚羥基乙酸的共聚物PLGA（四川國家生物材料工程公司）。

1.2 實驗動物及分組

雄性SD大鼠45只（江蘇大學實驗動物中心提供），隨機分為3組，每組15只。A組為自體神經移植組；B組為PLGA神經導管組；C組為PLGA神經導管聯合自體肌橋化學萃取組。

1.3 肌橋的化學萃取

所有實驗動物均在腹腔麻醉下，從左側股二頭肌處切取3 cm×2 cm×1 cm大小的肌條。采用Sondell法[1]進行化學萃取，制備無細胞基底膜管移植物，將股二頭肌肌條置于蒸餾水內，在室溫下保持7 h并換液數次，然后置于3%的Triton X-100蒸餾水溶液中室溫過夜（12 h），接著置于4%的Deoxycholate鈉鹽蒸餾水溶液中連續震蕩24 h，進行萃取處理。上述程序重復一遍，最后將萃取后的移植物水洗后置于4℃、pH 7.2的磷酸緩沖液中保存備用。

1.4 PLGA神經導管的制作[2]

聚乳酸和聚羥基乙酸的共聚物PLGA（85∶15）制成管長12 mm、壁厚0.3 mm、內徑1.5 mm的神經導管；導管置于P2O5的干燥器中，-20℃保存，導管植入體內前甲醛熏蒸4 h。

1.5 手術方法

10%水合氯醛腹腔注射麻醉。大鼠俯臥位，由原手術切口分離顯露大鼠左側坐骨神經，A組于坐骨神經中段切取神經干l0mm，近遠端顛倒后9-0線兩端各縫合2針。其他兩組均銳性切除坐骨神經干6 mm，讓斷端缺損自然回縮至10 mm；B組用9-0線將PLGA導管兩端縫合固定；C組將自體化學萃取肌肉修剪為長9 mm、直徑1.5 mm左右的橋段置入神經導管，神經斷端兩端各插入1mm，9-0線導管兩端縫合固定。術畢慶大霉素沖洗并關閉切口。術側大鼠下肢管形石膏固定，2周后去除石膏。

1.6 檢測方法

1.6.1 大體觀察

術后定期觀察各組術側足底、足趾的皮膚潰瘍情況，以及后肢肌肉萎縮程度和關節屈伸情況。

1.6.2 坐骨神經指數

術后第2、4、6、8周，各組SD鼠雙后足涂上碳素墨水，置于自制的大鼠足印行走箱中，得到相應足印，測量各指標，代入公式計算坐骨神經指數。參考文獻[3]的方法，選擇印跡清晰的足印分別測量正常足(N)和傷側足(E)的3個指標：足印長度（PL）即足尖到足跟的最大距離；足趾寬度（TS）即第1～5趾的距離；中間足趾寬度（IT）即第2～4趾的距離。坐骨神經指數=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS] +13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8。坐骨神經指數0%～-11%表示神經功能完全正常，-100%表示神經功能完全喪失，-11%～-100%表示部分神經功能恢復。

1.6.3 腓腸肌濕質量恢復率

仔細分離雙側腓腸肌，測量其濕質量，計算腓腸肌濕質量恢復率。腓腸肌濕質量恢復率(%)=手術側腓腸肌濕質量/正常側腓腸肌濕質量×100%。

1.6.4 組織學觀察

術后4周、8周和12周切取移植物，甲醛固定，石蠟包埋，甲苯胺藍染色，光鏡觀察。采用計算機圖像分析系統分析移植體中部的橫切面，計算出神經纖維有效面積、髓鞘厚度和神經纖維密度。

1.6.5 電鏡標本制作及觀察

自移植物中段取材，4%戊二醛、1%鋨酸固定，乙醇逐級脫水，Epon812包埋、切片，鉛－鈾染色，透射電鏡觀察。

1.7 統計學分析

所有數據用均數±標準差表示，應用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察

術后各組實驗動物均表現為左側后肢拖地行走，術后1周足部皮膚出現紅腫和足跟潰瘍，術后2周小腿三頭肌出現明顯萎縮，之后小腿三頭肌萎縮逐漸恢復，足跟部皮膚紅腫或潰瘍逐漸消退。至術后取材時各組大鼠均存活，切口愈合良好。

2.2 坐骨神經指數

術后2、4周，各組坐骨神經指數差異無統計學意義（P＞0.05）；術后8周，A組坐骨神經指數與B、C組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；移植后12周，A組坐骨神經指數略高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C組指數高于B組，差異有統計學意義（P＜0.01）（表1）。

表1 術后2、4、8、12周各組坐骨神經指數Table1 Sciatic nerve function index of each group 2,4,8 and 12 weeks after operation

2.3 小腿三頭肌濕質量恢復率

術后12周，A、B、C組小腿三頭肌濕質量恢復率分別為（75.2±4.7）%、（43.3±4.1）%和（61.9±4.4）%。C組與A、B組比較差異均有統計學意義（P＜0.01），C組與B組比較差異也具有統計學意義（P＜0.01）。

2.4 移植神經吻合口遠段甲苯胺藍染色觀察

12周取材后的甲苯胺藍染色顯示，C組再生的神經纖維較多，且排列整齊（圖1）,神經數量和軸突直徑以及髓鞘厚度均優于B組（圖2），差異有統計學意義（P＜0.01）。A組各項指標均強于C組，其中神經纖維有效面積（P＜0.01）和神經纖維密度（P＜0.05）差異具有統計學意義，A組髓鞘厚度稍強于C組，差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

圖1 C組12周再生神經中段橫切面觀（甲苯胺藍染色，400×）Fig.1 Transverse view of regenerated nerve of group C 12 weeks after operation(toluidine blue staining,400×)

圖2 B組12周再生神經中段橫切面觀（甲苯胺藍染色，400×）Fig.2 Transverse view of regenerated nerve of group B 12 weeks after operation(toluidine blue staining,400×)

表2 術后12周各組再生神經圖像分析結果Table2 Regenerated nerve image analysis of each group 12 weeks after operation

2.5 透射電鏡觀察

術后12周透射電鏡觀察，C組（圖3）相對于B組（圖4）再生的有髓神經纖維多，髓鞘較厚并且完整，板層排列緊密，軸突膜與髓鞘膜緊密相鄰；但是稍差于A組。

圖3 C組12周再生神經中段橫切面觀（透射電鏡，5 000×）Fig.3 Transverse view of regenerated nerve of group C 12 weeks after operation(TEM,5 000×)

圖4 C組12周再生神經中段橫切面觀（透射電鏡，5 000×）Fig.4 Transverse view of regenerated nerve of group B 12 weeks after operation(TEM,5 000×)

3 討論

眾所周知，長段的周圍神經缺損修復的最佳方法目前仍是自體神經移植，但是自體神經的來源有限，且可導致供區神經功能喪失或痛性神經瘤可能。為了獲得更佳的神經修復效果，人工神經成為目前研究的熱點之一。

以往的研究表明，單純神經導管移植能促進周圍神經的再生，療效接近自體神經移植。其原理就是神經斷端間用套管橋接，形成相對密閉的再生室，充分發揮神經再生的趨化特性、自我調節能力及自我修復能力。

有文獻報道，通過對骨骼肌進行化學萃取或冷熱變性后形成變性肌橋，來修復周圍神經的缺損[4-6]，取得了一定的效果。但是由于單純肌橋周圍沒有神經導管對外周環境進行隔絕，導致肌橋容易被炎性組織浸潤而導致疤痕化，或者被外周組織壓迫而影響再生的神經纖維，從而影響了促進神經再生的效果。

本實驗采用PLGA神經導管，聯合變性的肌橋來對周圍神經缺損進行修復。優點如下：①神經導管對肌橋和神經斷端周圍環境進行相對的隔絕，避免了周圍組織的壓迫和炎性組織的浸潤；②形成神經再生室，可充分發揮神經再生的自我調節、自我修復能力；③理想的人工神經應該能模擬自體神經的結構，具備三維立體支架結構，為再生的神經軸突和許旺細胞提供“腳手架”，使許旺細胞和軸突沿支架有序縱向排列，引導神經再生。本實驗采用化學萃取的方法制作肌肉基底膜管，來模擬形成一種中空網管狀結構[7-8]，肌肉基底膜含有層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，能促進周圍神經再生，有助于許旺細胞黏附及軸突沿支架延伸生長。自體肌肉基底膜管不會產生排斥反應[9]；④PLGA神經導管已得到美國FDA臨床應用許可，具有良好的組織相容性。

本實驗的各項檢測結果顯示，各組均能有效引導大鼠坐骨神經再生并通過大鼠坐骨神經缺損間隙，神經導管聯合化學萃取自體肌橋組神經修復效果優于單純的神經導管組，說明通過對自體肌肉化學萃取而形成的肌肉基底膜管能促進周圍神經的再生。但是神經導管聯合肌肉基底膜管組的神經修復效果仍然差于自體神經移植組。

為了進一步獲得更好的神經修復效果，我們將在后續研究中添加神經營養因子、種子細胞等，并進一步研究和比較各種肌肉變性方法所制作的肌肉基底膜管的性能、結構和神經修復效果差異。

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Denatured A utologous Muscle Graft Combining PLGA Nerve Guide Conduits in Repairing Peripheral Nerve Defects

LIZhen,ZHOU Ming.
Emergency Medical Center,Zhenjiang First People's Hospital,Zhenjiang 212002,China. Corresponding author:ZHOU Ming(E-mail：zhouming212002@163.com).

Objective To explore the feasibility of denatured autologous muscle graft combining PLGA Nerve guide conduits in repairing sciatic nerve defects in rats.M ethods Forty-five Sprague-Dawley rats were random ly divided into three groups(n=15)and the left sciatic nerve defectsmodelwas established on each rat.Autologous nerve(group A),PLGA nerve guide conduits(group B)and denatured autologousmuscle graft combining PLGA nerve guide conduits(group C)were used to bridge the nerve defects.Microscopic observation,sciatic nerve function index，recovery rate of gastrocnemius wet weight,histological observation and computerized imaging analysis were carried out postoperatively.Results The findings showed that denatured autologousmuscle graft combining nerve guide conduitswas better than nerve guide conduits,but less effective than autologous nerve transplantation.Conclusion Denatured autologous muscle graft combining nerve guide conduits can promote the peripheral nerve regeneration and repair nerve defects.

Nerve regeneration;Nerveguide conduits;Poly(lactide-co-glycolide);Denatured autologousmusclegraft

R622+.3

A

1673－0364（2012）03－0146－04

2012年3月2日；

2012年3月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.006

212002江蘇省鎮江市鎮江市第一人民醫院急診醫學中心。

周明（E-mail：zhouming212002@163.com）。