周期性張應力作用下成骨樣細胞MG-63中c-fos基因和絲狀肌動蛋白相互關系的研究

堵安慶 王羽 趙森 李煒鵬 趙志河

（1.四川大學華西口腔醫院 正畸科；2.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學，成都610041；3.中山大學光華口腔醫學院·附屬口腔醫院 正畸科；4.廣東省口腔醫學重點實驗室，廣州510055）

頜面部骨組織的生長改建受口腔應力環境的影響，例如：偏側咀嚼可使常用側下頜骨強壯、廢用側變弱，義齒修復可延緩牙槽骨吸收，正畸力可影響牙移動等。因此，研究骨細胞在應力作用下的反應對了解頜面部骨組織的生長改建機制具有重要意義。c-fos基因是即刻早期基因家族中的重要成員，能對各種細胞外刺激迅速作出反應。有研究[1]指出：c-fos基因是骨樣細胞對機械應力刺激反應的標記物。在正常細胞中，該基因的轉錄和表達水平都較低，而在應力等刺激因素作用下表達增高，被視為細胞力學信號轉導過程中的重要信號分子。另有研究[2-3]表明：細胞骨架參與了力學信號轉導過程中c-fos基因的表達，是應力誘導c-fos基因高表達的一個重要環節。對于成骨細胞c-fos基因和細胞骨架絲狀肌動蛋白（filamentous actin，F-actin）在周期性張應力作用下相互關系的研究還很罕見，本實驗擬從此方面進行探討，以期初步了解骨細胞在應力作用下的應答反應機理。

1 材料和方法

1.1 成骨樣細胞MG-63的培養

將MG-63細胞按每毫升1×104個細胞的密度接種于聚苯乙烯培養瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養，隔天換液，待細胞生長達80%融合時，按1∶1的比例傳代培養。

1.2 MG-63細胞加力

參照本課題組前期的研究方法[4]對MG-63細胞加力。加力板由聚苯乙烯培養瓶切割而成，大小為4 cm×8 cm，厚度為1.15 mm。要求加力板周緣平滑、四角圓鈍，以避免加力過程中出現應力集中。

采用傳代后的細胞，消化離心后按每毫升1×105個細胞的密度接種于加力板中1/3區域（實驗組和對照組同時種板），每板接種1 mL細胞懸液（即每板含1×105個細胞），置入培養皿中，于37 ℃孵箱中培養。培養4 h后，鏡下觀察待細胞完全貼壁后，加入20 mL培養基繼續培養。加載前24 h，更換為無血清培養基，以同步化細胞周期。

采用Forcel四點彎曲加力裝置，對接種在加力板上的MG-63細胞施加周期性張應力，頻率為0.5 Hz，細胞應變為2 000 μstrain，按3、6、12 h不同時間段加力，使細胞在平行于貼壁方向上發生單軸牽張應變，每組重復3次。對照組不加力。每組3個樣本均來自同一瓶培養細胞，以相同的密度和細胞量接種，除應力影響因素外，其他條件基本一致。

1.3 c-fos mRNA的熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測

用Trizol提取各組細胞的總RNA。熒光定量PCR擴增前，隨機抽取3個實驗樣本的總RNA各5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，觀察28S和18S rRNA條帶的亮度，測量260 nm和280 nm處的光密度（optical density，OD）值，計算二者的比值，觀察有機物的污染情況。將RNA逆轉錄成cDNA后行熒光定量PCR檢測，檢測MG-63細胞在不同加力時間內c-fos mRNA的表達情況。

熒光定量PCR具體步驟如下。1）預混合下列溶液于PCR反應管中，包括10×buffer（不含Mg2+）3 μL、MgCl2（25 mmol·L-1）3 μL、dNTP（25 mmol·L-1）0.36 μL、正向引物（10 μmol·L-1）1 μL、反向引物（10 μmol·L-1）1 μL、SYBR Green Ⅰ核酸凝膠染液（10 μmol·L-1）2 μL、Taq聚合酶（5 U·μL-1）0.3 μL、ddH2O 17.34 μL、cDNA模板2 μL，總體積30 μL。2）反應體系在FTC-2000型熒光定量PCR儀上進行，擴增條件如下：94 ℃2 min；94 ℃20 s、52 ℃20 s、72 ℃30 s、80 ℃20 s，共45個循環。3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參。擴增反應結束后，根據擴增動力學曲線確定每個樣品管中熒光強度增加到閾值時的擴增循環數Ct。用2-ΔΔCt[5]計算各時間點相對于0 h基因表達的比值。cfos和GAPDH的引物序列如下。c-fos正向引物：5’-gcgcagagcattggcagga-3’，反向引物：5’-cctcagcttggcaatct-3’；GAPDH正向引物：5’-gggtgtgaaccatgagaagt-3’，反向引物：5’-ccaaagttgtcatggatgacct-3’。

1.4 F-actin的激光掃描共聚焦檢測

選取c-fos基因表達高峰的時間點3 h為實驗組，以0 h組樣本為對照，進行F-actin和二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI）的免疫熒光雙染色，步驟如下：1）3.7%多聚甲醛固定樣本15 min，PBS漂洗3次，每次5 min，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）37 ℃封閉30 min；2）滴加5 μg·mL-1的F-actin染色劑鬼筆環肽-異硫氰酸熒光素（phalloidinfluorescein isothiocyanate，phalloidin-FITC）（Sigma公司，美國）于加力板中1/3區域，37 ℃濕盒內避光孵育60 min，PBS漂洗3次，每次5 min，避光保存；3）滴加5 μg·mL-1的細胞核染色劑DAPI于加力板中1/3區域，室溫避光染色5 min；PBS漂洗3次，每次5 min，避光保存。染色完成后在激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）（Leica公司，德國，TCS SP2型）下觀察，打開激光發生器掃描樣本，所有檢測按同樣的系統設置來完成。FITC和DAPI的激發光波長分別為495 nm和370 nm，發射光波長分別為520 nm和455 nm；綠色染色為F-actin，藍色染色為細胞核。檢測后應用Image J 1.44e圖像處理軟件隨機對每一加力板上的6個細胞進行圖像分析，測量F-actin的熒光強度（單位面積的熒光顆粒數），每組重復測量3次。

1.5 細胞松弛素D對c-fos基因表達和F-actin的影響

將細胞接種在加力板上，培養48 h并同步化后，用含有微絲細胞骨架解聚劑細胞松弛素D（cytochalasin D）的DMEM培養基（質量濃度為0.1 μg·mL-1）孵育1 h后再對細胞施加周期性張應力，頻率為0.5 Hz，細胞應變為2 000 μstrain，時間為3 h。對照組為相同時間的單純加力組。加力后收集樣本，進行c-fos mRNA熒光定量PCR檢測和F-actin及DAPI免疫熒光雙染色，觀察二者的表達變化。

1.6 統計分析

用SPSS 12.0統計軟件處理數據。3組及3組以上的樣本數據比較采用單因素方差分析，如差異有統計學意義，再行SNK檢驗；兩組數據間的比較采用配對t檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 MG-63細胞加力和RNA提取

加力3、6、12 h后，收集各組細胞的培養液，鏡下觀察均未見細胞，證明加力沒有造成細胞的死亡和脫落。各組細胞總RNA樣品條帶清晰，28S rRNA的條帶亮度大于18S，OD260nm/OD280nm值為1.95，表明RNA提取質量良好，沒有蛋白質等有機物的污染。

2.2 周期性張應力作用下MG-63細胞中c-fos mRNA的表達變化

在2 000 μstrain周期性張應力作用下，MG-63細胞中c-fos mRNA表達的情況見圖1。由圖1可見：MG-63細胞中c-fos mRNA表達增加，至3 h達到峰值，然后逐漸下降，到12 h降至正常水平。經統計學檢驗，c-fos mRNA在3 h的表達明顯高于0 h（P＜0.01），6 h的表達也高于0 h（P＜0.05），12 h的表達與0 h的差異則無統計學意義（P＞0.05）。這表明周期性張應力可以誘導c-fos mRNA出現短暫、一過性的表達。選取c-fos基因表達高峰的時間點3 h用于后續實驗。

圖1 周期性張應力作用下，MG-63細胞中c-fos mRNA的變化Fig 1 The change of c-fos mRNA in MG-63 osteoblasts under cyclic tensile stress

2.3 周期性張應力作用下MG-63細胞中F-actin的表達情況

F-actin的激光掃描共聚焦觀察結果見圖2：0 h組可見F-actin包繞細胞核排列，細胞核區有少量分布，呈染色均勻一致的膜狀結構，無明顯的方向性（圖2A）；3 h組F-actin在細胞內聚集形成應力纖維，細胞內可見明顯的非極性并行排列的應力纖維，細胞體牽拉，邊緣粗糙不規整，出現鋸齒樣結構（圖2B）。F-actin的平均熒光強度值見圖3：經配對t檢驗分析，兩個時間點F-actin的熒光強度的差異無統計學意義（P＞0.05）。結合圖2、3可以看出：隨著應力的加載，F-actin微絲蛋白的量并沒有改變，只是出現了結構上的重組。

圖2 MG-63細胞中F-actin的表達 LSCM×400Fig 2 The expression of F-actin in MG-63 osteoblastsLSCM×400

圖3 MG-63細胞中F-actin的平均熒光強度Fig 3 The mean fluorescence intensity values of F-actin in MG-63 osteoblasts

2.4 細胞松弛素D對c-fos mRNA和F-actin表達的影響

加入細胞松弛素D后，鏡下觀察可見細胞仍然貼壁生長，符合后續實驗的加力要求。c-fos mRNA表達的變化見圖4：與單純加力組相比，加入細胞松弛素D后c-fos mRNA的表達明顯降低（P＜0.01），提示細胞松弛素D對張應力誘導的c-fos mRNA表達有抑制作用。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察可見：經細胞松弛素D處理后的MG-63細胞體內形成的應力纖維明顯減少（圖5）。F-actin的熒光強度值見圖6，可見經細胞松弛素D處理后，F-actin的熒光強度明顯降低（P＜0.01）。

圖4 周期性張應力作用下加入細胞松弛素D對c-fos mRNA表達的影響Fig 4 The change of c-fos mRNA expression after treated by cytochalasin D under cyclic tensile stress

圖5 細胞松弛素D對F-actin表達的影響 LSCM×400Fig 5 The change of F-actin expression after treated by cytochalasin D LSCM×400

圖6 加入細胞松弛素D后F-actin的平均熒光強度Fig 6 The mean fluorescence intensity values of F-actin after treated by cytochalasin D

3 討論

本實驗發現：在周期性張應力作用下，MG-63細胞中c-fos mRNA的表達增加，至3 h達到峰值，隨后逐漸下降，12 h降至正常水平。該結果與Kletsas等[1]的研究結果一致。Kletsas等[1]研究表明：周期性應力加載0.5 h后c-fos出現表達，至3 h達到高峰，隨后逐漸下降，12 h降至正常水平。這表明周期性張應力可以誘導c-fos mRNA呈現短暫、一過性的表達。

本研究結果顯示：在應力加載作用下，F-actin微絲蛋白的量并沒有明顯變化，只是出現了結構上的重組。從量上來說，F-actin似乎是穩定的，并沒有隨著應力的加載而出現動態改變。這與其他學者[6-7]的研究結果不同。但Knight等[8]的研究也得出了與本實驗類似的結果。Knight等[8]認為：在壓應力作用下，與F-actin結合的蛋白和鈣調節蛋白被激活，引起Factin重組；發生重組時，沒有出現F-actin基因表達的變化，表明重組的是既有的F-actin。還有研究[9-10]證實：力學刺激是通過F-actin的重組來作用于細胞的。重組暫時改變了細胞的力學特性，通過這種反饋機制，細胞得以受到生理負荷的調節。本實驗中，F-actin的重組使MG-63細胞發生形變，可見細胞受到了力學載荷的調節。

細胞松弛素D是微絲細胞骨架解聚劑，其作用機制是增加游離微絲的片段并阻止微絲重組[11]。加入細胞松弛素D后，細胞內F-actin的重組受抑制，形成的應力纖維明顯減少，同時熒光強度降低，說明F-actin的量減少；與此同時，c-fos mRNA表達明顯降低。Knight等[8]指出：F-actin的重組很可能參與了應力誘導c-fos基因的高表達。Pavalko等[2]發現：流體剪切力作用1 h后即能增加細胞中c-fos的表達，而導致這種現象產生的機制是應力作用下細胞骨架的重組。有研究[12]指出：整合素、微絲細胞骨架、膜受體蛋白G蛋白能作用于力學信號轉導通路，抑制上述三方的任意之一均能抑制即刻早期基因的表達。張應力作用下，F-actin的表達和重組受抑制的同時c-fos基因的表達也明顯降低，證實了F-actin重組是應力誘導c-fos基因高表達的一個重要環節。

由本研究結果可見：在應力加載作用下，F-actin微絲蛋白的量并沒有發生變化，只是出現了結構上的重組，而且重組的是既有的F-actin；F-actin重組是應力誘導c-fos基因高表達的一個重要環節。

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