骨形態發生蛋白-2與堿性成纖維細胞生長因子在異位和原位成骨中的作用

王磊 章燕 游素蘭 譚鸞君 黃遠亮

（1.上海市長寧區虹橋街道社區衛生服務中心 口腔科，上海200051；2.同濟大學附屬口腔醫院 口腔頜面外科，上海200072；3.同濟大學附屬東方醫院 口腔科，上海200120；4.上海浦東醫院 口腔科，上海200130）

采用組織工程骨修復各種類型的骨缺損是目前學者們關注的熱點。骨髓基質細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）、支架材料和骨生長因子是組織工程骨修復骨缺損過程中的重要組成部分[1]。添加適當的骨生長因子是培養BMSCs和誘導新骨生成的方法之一。

骨誘導和骨生成是一個由多種生長因子參與并調節的過程。骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是骨基質中存在的兩種重要的骨生長因子，能誘導未分化的間充質細胞不可逆地分化形成軟骨和骨，從而形成新骨。動物實驗證明BMP-2和bFGF兩種因子之間的相互作用會影響骨的形成[2-5]。本實驗研究兩種因子在體外對細胞的增殖和分化作用，以及在異位和原位成骨方面的作用，以更好地探討兩種因子在促進骨形成中的價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物采用1歲普通級Beagle犬和5周齡健康Nu/Balb-c裸鼠，經上海實驗動物質檢站檢測合格，由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物中心提供和飼養。

1.2 實驗材料和儀器

BMP-2、bFGF（Peprotech公司，英國），多孔磷酸鈣（calcium phosphate cement，CPC）（上海瑞邦生物材料有限公司）；恒溫CO2培養箱（Quene System公司，美國），Axioplan 2多功能全自動顯微鏡、KS400圖像分析系統Ver 3.0（ZEISS公司，德國），Pixera 150CL熒光顯微數碼成像系統（Pixera公司，美國）。

1.3 BMP-2和bFGF對BMSCs增殖和分化作用的體外實驗

采用常規方法[6]獲取Beagle犬的骨髓，體外培養BMSCs，將傳至第2代的BMSCs以每毫升5×103的密度接種于96孔培養板，使用條件培養液培養，每孔加培養液200 μL，培養24 h后棄去培養液及未貼壁的細胞，分別加入含不同生長因子的細胞培養液進行實驗。

A1組加入質量濃度為100 ng·mL-1的BMP-2；B1組加入質量濃度為50 ng·mL-1的bFGF；C1組加入質量濃度為100 ng·mL-1的BMP-2和50 ng·mL-1的bFGF；D1組為對照組，僅加入DMEM誘導液，不含任何生長因子。每組設6孔，置于恒溫CO2培養箱于37 ℃、5%CO2、飽和濕度環境中進行培養。連續6 d應用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法測定細胞的增殖水平，同時定量檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性以觀察細胞的分化情況。

1.4 制備BMSCs和生長因子與CPC的復合材料

準備48粒5 mg CPC，分別放于EP管中，每粒大小約為3 mm×2 mm×2 mm，可吸收培養液約15 μL。實驗分4組，每組12粒CPC，分別加入含不同成分的培養液：A2組加入BMSCs+100 ng·mL-1BMP-2，B2組加入BMSCs+50 ng·mL-1bFGF，C2組加入BMSCs+100 ng·mL-1BMP-2+50 ng·mL-1bFGF，D2組只加入BMSCs。培養液要將CPC材料充分浸潤，制備成復合材料，備用。

1.5 復合材料異位成骨實驗

取上述復合材料分別植入8只裸鼠背部皮下組織內。于裸鼠背部脊柱兩側距中線1.5 cm處，分左上、左下、右上、右下4個區，分別植入上述4組復合材料各1個。于術后12周處死動物，取材，進行常規脫水、石蠟包埋，制備切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。每個標本的切片隨機選取3張，運用Axioplan 2多功能全自動顯微鏡、KS400圖像分析系統Ver 3.0分析和計算各組的新骨形成百分比。

1.6 復合材料原位成骨實驗

分別拔除6只Beagle犬雙側下頜第二、三、四前磨牙和第一磨牙。術后3個月，于雙側下頜缺牙區按照種植手術的操作程序植入Br?nemark種植體，每側植入3枚，共6枚，同時制備種植體周圍骨缺損（圖1）。植入的種植體直徑為3.75 mm、長為10 mm。手術過程：采用Br?nemark種植外科器械工具，每側用球形鉆定位3個植入位點，間距為1.5 cm，利用2 mm直徑的先鋒鉆制備10 mm深度洞型，然后利用7 mm直徑環形取骨鉆制備量化的種植體周圍骨缺損（要求外直徑為7.0 mm、深為4.0 mm），其后依次備洞，植入Br?nemark種植體。

根據種植體周圍骨缺損容積的大小，將重新復合的4組多孔CPC材料分別植入同一只犬制備好的4個種植體周圍骨缺損中（A2、B2、C2、D2組），其余兩個骨缺損中一個僅植入純CPC（E2組），另一個作為空白對照（F2組）。植入后松弛黏膜，對位縫合。術后觀察實驗動物的呼吸和出血情況。術后1周內每日肌肉注射40萬U青霉素以抗感染，于術后12周處死動物。處死動物前14 d腹腔注射鈣黃綠素（每千克體重20 mg），處死前3 d腹腔注射四環素（每千克體重25 mg），以進行熒光雙標記[7]。處死當天注射過量速眠新處死動物，10%中性緩沖甲醛溶液內固定下頜骨。取雙側下頜骨標本，分別鋸開分成6個標本，固定于10%中性緩沖甲醛溶液中，梯度乙醇脫水，固化包埋。將包埋好的標本固定在Leica-SP1600型硬組織切片機上，連續切片，然后用氧化鋁耐水砂紙磨片，制備成5 μm厚切片。熒光顯微鏡觀察切片，并用顯微鏡攝像系統拍攝熒光圖片，Pixera 150CL熒光顯微數碼成像系統傳輸至電腦，通過Simple PCI圖像分析系統測定四環素和鈣黃綠素雙標記間距，計算礦化沉積率（mineralization apposition rate，MAR）。MAR（μm·d-1）=四環素鈣黃綠素雙標記間距/標記間隔天數。標本切片另行Van Gieson苦味酸品紅染色，觀察成骨細胞、類骨質、礦化骨及新礦化骨的分布情況。

圖1 Beagle犬下頜骨種植體周圍骨缺損Fig 1 Bone defect around implants in the mandible of Beagle dog

1.7 統計學分析

使用SPSS 12.0軟件對MTT和ALP測量結果，以及MAR值和新骨形成百分比進行方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 BMP-2和bFGF對BMSCs增殖和分化作用的體外實驗結果

A1（BMP-2）、B1（bFGF）、C1（BMP-2+bFGF）和D1（對照）組MTT均值分別為0.337±0.029、0.312±0.020、0.459±0.036、0，ALP均值分別為0.130±0.016、0.118±0.003、0.206±0.000、0。經統計學檢驗，各組間MTT值和ALP活性的差異均有統計學意義（P＜0.05），C1組＞A1組＞B1組。

2.2 復合材料異位成骨實驗結果

4組復合材料植入裸鼠背部12周后，可見各組標本被纖維組織包裹，標本內部均有骨組織形成（圖2）；A2組（CPC+BMSCs+BMP-2組）和B2組（CPC+BMSCs+bFGF組）標本內部可見骨組織，并伴有炎性細胞浸潤；C2組（CPC+BMSCs+BMP-2+bFGF組）可見形成較多均勻的骨組織，血管數量增加。各組新骨形成的百分比測定值分別為：A2組為30.71%±10.85%，B2組為27.33%±9.67%，C2組為48.79%±11.31%，D2組為10.65%±6.05%；經統計學檢驗，C2組＞A2組＞B2組＞D2組。

2.3 復合材料原位成骨實驗結果

復合材料植入種植體周圍骨缺損12周后，通過硬組織切片觀察到種植體周圍有新骨形成，新骨與種植體結合緊密，CPC顆粒被整合或降解。F2組（空白對照組）種植體周圍骨缺損依然存在，種植體頸部未形成骨結合；而其他組的種植體周圍骨缺損已形成新骨，但新舊骨之間界線明顯，種植體頸部同新骨形成良好的骨結合，大部分復合材料顆粒已被新骨吸收替代。經Van Gieson染色后，各組均能夠清楚地觀察到骨的結構（圖3）。各組MAR測定值分別為：A2組為（1.582±0.095）μm·d-1，B2組為（1.433±0.131）μm·d-1，C2組為（1.941±0.107）μm·d-1，D2組（1.281±0.066）μm·d-1，E2組（1.104±0.087）μm·d-1，F2組（0.261±0.109）μm·d-1；經統計學檢驗，C2組＞A2組＞B2組＞D2組（P＜0.01），4個實驗組均高于2個對照組。

圖2 術后12周骨形成情況 HE×10Fig 2 Bone formation at 12 weeks postoperatively HE×10

圖3 術后12周的硬組織切片觀察 Van Gieson染色×100Fig 3 The undecalcified sections at 12 weeks postoperatively Van Gieson staining×100

3 討論

BMP-2能誘導促進多種細胞的增殖和分化，誘導新骨形成。bFGF在細胞存活、增殖、分化、黏附、遷移、血管生成中發揮了重要的調節作用。在生長因子中，bFGF對BMSCs具有最強的促增殖作用，不僅能提高BMSCs的增殖速度和壽命，而且能在增殖過程中保持其多分化潛能[8]。

本實驗觀察了體外培養的BMSCs對BMP-2和bFGF的反應。BMP-2能促進BMSCs的增殖和分化，特別是誘導未分化的基質細胞不可逆地分化為軟骨細胞和成骨細胞；bFGF可以通過促進成骨細胞有絲分裂，增加細胞內骨鈣素的含量，增加DNA合成從而增加成骨細胞數[9]。

有實驗[10]證實：BMP-2和bFGF在促細胞增殖和分化方面有協同作用。胡運生等[11]用bFGF和BMP-2培養兔的BMSCs，發現bFGF可促進BMP-2對細胞的分化作用。本實驗通過MTT和ALP檢測，研究BMP-2和bFGF對BMSCs的增殖和分化的作用，結果顯示：二者共同作用組促進BMSCs的增殖和分化作用最強，且均高于單一因子組，說明BMP-2有明顯的誘導BMSCs分化的作用，同時bFGF可增強BMSCs的增殖作用。

本研究通過體內異位和原位成骨實驗觀察BMP-2和bFGF促進骨形成的情況。BMP-2活性因子可啟動骨形成過程，為bFGF提供了大量的靶細胞，加速了骨修復，二者之間有協同作用。有研究[12]顯示：BMP-2、bFGF可以通過不同的信號通路對不同分化階段的細胞起調節作用，BMP-2可上調自體生長因子并加快誘導成骨過程。還有研究[13]發現：bFGF在刺激毛細血管內皮細胞遷移和增殖的同時，可促進纖溶酶原激活物和膠原酶的分泌，促進膠原合成和小血管的形成，是一種強大的血管生成因子。

多孔CPC的骨引導能力與BMP-2和bFGF的高效骨誘導活性相結合，可以產生兩方面的作用：一方面BMP-2和bFGF吸附于多孔CPC表面，隨著多孔CPC的吸收緩慢釋放，其骨誘導活性得以持續發揮；另一方面多孔CPC支架結構有利于新生骨的長入，以維持缺損區的外形。多孔CPC與BMP-2和bFGF復合材料的優越性不僅僅在于可以增加成骨量，還表現在形成較多的板層骨，骨的成熟程度更高。

本實驗通過異位和原位成骨實驗，探討了BMP-2和bFGF在成骨過程中的作用。結果顯示：BMP-2和bFGF復合CPC材料的骨和血管形成最多,可能新生血管的形成促進了需要血液供應的軟骨內化骨，加速了軟骨痂的成熟和骨化。本研究中，CPC+BMSCs+BMP-2+bFGF組可觀察到與成骨相伴的毛細血管增生，其毛細血管數量顯著多于CPC+BMSCs+BMP-2組，并且向中央區生長；術后12周隨著骨改建出現髓腔再通。推測是由于bFGF可加速新生毛細血管的較快發展，協同BMP-2促使成骨量增加，軟骨成熟提前。該組骨礦化率最高，均高于單一因子組，說明BMP-2只有在這些調節因子的共同參與下，才能更好地誘導新骨形成。bFGF是目前發現的體內最有效的血管形成因子之一[14]，新生血管的形成在骨缺損愈合中起關鍵作用，bFGF協同BMP-2作用，彌補了單一使用BMP-2的不足。

生長因子和細胞的這種相互關系，其意義在于構建組織工程化人工骨時，要十分重視生長因子的合理使用，調控成骨細胞適時適量地表達生長因子，這樣可實現成骨細胞的快速增殖，并形成大量骨組織以替代人工骨，實現人工骨的快速血管化使人工骨和自然骨完全整合。從本研究結果可以看出，骨生長因子在骨誘導和骨生成中的調節作用必不可少，在適宜的劑量和載體條件下，骨生長因子促進了新骨的形成。

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