Indian Hedgehog在牽張力促進成骨細胞增殖中的作用研究

韓磊 張曉玲 唐國華

（1.南京大學醫學院附屬口腔醫院 口腔正畸科，南京210025；2.中國科學院上海生命科學研究院/上海交通大學醫學院健康科學研究所 骨科細胞與分子生物學實驗室；3.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 口腔正畸科，上海市口腔醫學重點實驗室，上海200011）

牙槽骨和顱頜面骨是應力豐富區，也是成骨細胞活躍區。在外界機械應力刺激下，成骨細胞的增殖分化是骨組織發生適應性改建和骨再生重建的源泉[1]。越來越多的實驗證實牽張力是有效促進成骨細胞活性和功能的力學刺激。現有的研究發現：與力學有關的信號包括細胞外調節蛋白激酶-1/2（extracellular regulated protein kinases-1/2，ERK-1/2）信號通路、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）信號通路、促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號通路、鈣離子通道、Rho蛋白及相關蛋白激酶（Rho/Rho-associated coiled-coil containing protein kinase，Rho/ROCK）通路、骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）通路、Hedgehog通道、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路等。回顧與Hedgehog相關的一些研究，筆者了解到在脊椎動物中，Hedgehog（Hh）蛋白家族至少含有3種成員，分別為Sonic Hedgehog（Shh）、Indian Hedgehog（Ihh）和Dersert Hedgehog（Dhh）[2]。所有的Hh蛋白均可通過自身裂解過程產生一個C末端和功能性N末端結構域，并且裂解的部位相當保守。Ihh與Shh的C末端有明顯的區別，而N端結構93%一致，故兩者有相似的生物學作用[3]。Hh受體Patched（Ptch）為一類12通道的跨膜蛋白，Hedgehog信號的傳導通過Smoothened（Smo，一類G蛋白偶聯的多通道膜蛋白）而發揮作用。缺乏Hedgehog蛋白時，Smo與Ptch結合處于抑制狀態。當Hedgehog蛋白與Ptch結合后導致Smo釋放，活性狀態的Smo激活目的基因的轉錄活性，最終誘導一系列下游信號分子的釋放，發揮其調控作用[3-4]。Hedgehog通道抑制劑環巴胺（cyclopamine，cy）是一種植物性甾體類生物堿，主要通過對抗Smo而抑制Hh信號通路[5]。Hedgehog信號參與調節骨的生長發育，其中Ihh對經歷軟骨內成骨的四肢骨及大部分顱面骨的作用明顯。Ihh在軟骨細胞和成骨細胞的增殖和分化中起調節作用[3]。進一步研究發現：Ihh在成骨細胞中也有表達[6]。同時研究表明：Ihh是一個機械傳導因子，在下頜前導實驗中，牽張力會激發下頜髁突增殖層細胞Ihh的表達，進而促進間充質細胞的增殖[7]。基于此，筆者提出假設：Hedgehog信號可能在機械應力介導的成骨細胞增殖中發揮調控作用。因此本實驗的研究目的是通過建立成骨細胞體外培養加力模型，研究牽張力下Hedgehog家族中Ihh對成骨細胞增殖的作用，從而探索機械應力對成骨細胞增殖的調控機制。

1 材料和方法

1.1 材料

新生SD大鼠（中國科學院斯萊克動物中心），鼠N端Hedgehog重組蛋白（N-terminus Sonic Hedgehog，N-Shh）（R&D公司，美國），環巴胺（Biomol公司，美國），三氯化釓（GdCl3）、0.25%胰酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國），α-MEM培養基（Gibco公司，美國），含100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1鏈霉素（Invitrogen公司，加拿大）的雙抗，甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Promega公司，美國），流式細胞儀（BD公司，美國），Flexcell 4000TM加力系統（Flexcell公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞的分離鑒定 取出生不足24 h的新生SD大鼠，在無菌條件下獲取顱頂骨，采用次序性酶消化法分離成骨細胞[8-9]，加入含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的α-MEM培養基，接種于75 cm2培養瓶，次日吸去殘留骨片后隔日換液，細胞80%～90%匯合時傳為P1代。

1.2.2 成骨細胞加力 常規細胞復蘇，用含10%小牛血清（fetal calf serum，FCS）的α-MEM培養液重懸細胞，隔日換液。當細胞生長達85%匯合時，按照每個培養皿每平方厘米1×105個細胞傳代于Flexcell加力板上，細胞種板日標記為0 d；培養24 h后，換無血清的培養液培養24 h，使細胞狀態同步化；重新加入10%FCS的α-MEM培養基之后，分別對成骨細胞施加變形率為3%和6%（頻率為0.5 Hz、1/2正弦波形）的循環式牽張力，作用時間分別為4、12、24、36、48、60、72 h；對照組成骨細胞未施加循環式牽張力。每個樣本有3個復孔。

1.2.3 成骨細胞形態學觀察 在3%和6%牽張應變作用24 h后，在加力板內加入固定液，顯微鏡觀察成骨細胞形態。

1.2.4 成骨細胞增殖能力分析 對成骨細胞施加4、12、24、36、48、60、72 h的循環式牽張力，每個樣本有3個復孔，加力結束后收樣，通過MTT比色法檢測細胞的相對數。運用流式細胞儀技術進行細胞周期分析。選擇24 h的時間點對成骨細胞進行干預，在成骨細胞接種于Flexcell加力板的第2天分別加入100 ng·mL-1N-Shh和2.5 μmol·L-1cy后同步化處理，在加力前15 min分別加入10 μmol·L-1的GdCl3，加力結束后收樣檢測細胞相對數和細胞周期。

1.3 統計學分析

采用SAS 8.0軟件包對結果進行t檢驗，每次實驗重復3次，數據用±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成骨細胞鑒定結果

取P2代細胞，培養1周后多數細胞表現為堿性磷酸酶染色陽性；經含β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸的培養基培養，2周后可形成明顯的礦化結節，茜素紅染色為鮮紅色，證實所獲得的成骨細胞具有體外成骨功能。

2.2 成骨細胞形態學觀察

成骨細胞受到周期性牽張應變作用后的形態學觀察結果見圖1。在3%牽張應變作用24 h后，加力板邊緣原來呈現短梭形的成骨細胞被拉長，呈成行排列，與受力方向垂直；中間部分細胞仍呈不規則排列，但細胞體積增大。6%牽張應變作用下成骨細胞形態變化與受到3%牽張應變類似。

2.3 成骨細胞增殖能力分析

2.3.1 不同大小牽張應變對成骨細胞增殖的影響 細胞計數顯示，3%牽張應變作用12、24、36、48 h后，加力組較對照組成骨細胞數目顯著增加，二者間差異有統計學意義（P＜0.05）；而在加力60、72 h后，2組細胞數目間差異無統計學意義（圖2）。6%牽張應變下成骨細胞數目的變化趨勢與3%類似（圖2）。流式細胞儀定量檢測顯示，3%牽張應變作用下成骨細胞進入S期的比例在加力24和48 h后分別比對照組增加了70%和20%；6%牽張應變作用下成骨細胞進入S期的比例在24和48 h后分別比對照組增加了80%和35%。

圖2 牽張應力對成骨細胞增殖的影響Fig 2 The effect of stretching force on cell proliferation

施加牽張應變24 h后，與3%牽張應變相比，6%牽張應變對成骨細胞增殖的促進作用更明顯（圖3、4）。當使用GdCl3處理后，3%和6%牽張應變均不能促進成骨細胞的增殖（圖3、4）。

2.3.2 Hedgehog在牽張應變促進成骨細胞增殖中的作用 對成骨細胞施加牽張應變24 h，細胞周期檢測顯示，Hh通道抑制劑cy抑制了6%牽張應變對S期比例的促進作用，使S期比例降低了40%（圖5）；加入cy后，加力組較cy處理組在S期比例上差異有統計學意義（P＜0.05，圖5），再加入機械通道抑制劑GdCl3后，更能抑制S期比例（P＜0.05，圖5）。加入Hh通道增強劑N-Shh后，加力組較對照組S期比例升高（P＜0.05，圖6）。成骨細胞在受到6%牽張應變后，加入N-Shh組與不加N-Shh組在S期比例上差異無統計學意義（圖6）。

圖3 牽張應變和GdCl3對成骨細胞數目的影響Fig 3 The effect of stretching force and GdCl3 on cell proliferation of osteoblasts

圖4 牽張應變和GdCl3對細胞S期比例的影響Fig 4 The effect of stretching force and GdCl3 on S phase ratio

圖5 cy和GdCl3對牽張應力下成骨細胞增殖的影響Fig 5 The effects of cy and GdCl3 on the stretch induced proliferation of osteoblasts

圖6 N-Shh對牽張應變下成骨細胞增殖的影響Fig 6 The effect of N-Shh on the stretch induced proliferation of osteoblasts

3 討論

成骨細胞是骨修復、重建過程中重要的功能細胞，具備增殖、分化、分泌骨細胞外基質的能力[10-12]。牽張應變促進成骨細胞增殖的機理仍然不是很清楚。目前發現的與增殖激活有關的基因有c-Myc、c-Fos、c-Jun等[13-16]。先期研究發現：Ihh對軟骨內成骨過程中成骨細胞的增殖是必需的。本研究發現：Ihh參與了成骨細胞力學傳導和細胞增殖兩種過程。作用于成骨細胞的牽張力經過一系列信號傳導促進Ihh信號的表達，Ihh信號進一步介導成骨細胞的增殖。

本實驗采用的Flexcell 4000TM系統能夠將動態的、可控性強的力學信號作用于體外培養的成骨細胞。成骨細胞形態學觀察結果提示加力板邊緣的成骨細胞受到單軸牽張力，而加力板中央的大部分成骨細胞受到等軸牽張力。Flexcell 4000TM系統所施加的力學信號主要有力值大小、頻率、波形、作用時間4個重要的參數。從模擬生理環境的角度，本實驗采用了中度變形幅度（3%和6%）、低頻（0.5 Hz）間斷刺激[10-12]。生理情況下的力通常是由無到最大值一個連續緩慢的變化過程，所以采用1/2正弦波形。在牽張應變作用48 h內，加力組較對照組成骨細胞數目顯著增加，而在加力60、72 h后，2組細胞數目差異無統計學意義。這可能與成骨細胞對周期性牽張應力的作用時間（或總周期數）具有“扳機點”效應有關[11]。對成骨增殖周期進行定量檢測結果顯示：受到牽張應變后，成骨細胞處于S期比例的細胞數目增多，牽張應力能促進成骨細胞的增殖，并且此促進作用主要發生在48 h內，6%牽張應變對成骨細胞刺激較3%牽張應變更明顯，因此，在后續實驗中，主要選取24 h，6%牽張應變的參數。GdCl3被認為是特異性的機械通道抑制劑[17]。當先使用GdCl3后再施加牽張力，3%和6%牽張應變均不能促進成骨細胞的增殖。這些結果均證實牽張應變能促進成骨細胞增殖。

筆者在前期實驗中發現：變形率為6%的牽張應變作用于成骨細胞4、12、24 h后，Hedgehog家族中的Ihh基因表達分別增加了20%、110%和50%，6%的牽張應變較3%牽張應變對Ihh基因表達的促進作用更明顯。這提示Hedgehog家族中的Ihh信號對力學刺激敏感。使用GdCl3阻斷牽張力通道，GdCl3能完全抑制牽張力對Ihh表達的促進作用。這提示Ihh基因對力學刺激敏感，牽張應變通過成骨細胞膜表面的機械力通道調節Ihh基因的表達。基于上述發現，本實驗進一步研究Ihh信號與牽張應變下成骨細胞增殖間的關系。

為了揭示Ihh信號在牽張應變促進成骨細胞增殖中的作用，筆者分別觀察了Hh通道增強劑N-Shh、Hh通道抑制劑cy以及機械通道抑制劑GdCl3對牽張應力下成骨細胞增殖的影響。前期實驗證實：N-Shh干預成骨細胞后，其數目及處于增殖期（S期）的細胞比例增多[6]。而經過cy處理后的細胞數量和S期細胞數均明顯減少。這提示：Hedgehog信號促進成骨細胞的增殖。筆者在實驗中發現Hedgehog通道抑制劑cy不但阻斷了6%牽張應變對S期比例的促進作用，而且使S期比例降低了40%，這與前期的研究結果一致[6]，同時也提示cy對成骨細胞增殖的抑制作用大于牽張力的促進作用。為了進一步研究Ihh是否是牽張應力促進成骨細胞增殖的唯一途徑，分別加入cy和（或）GdCl3。加入cy后再施加牽張力仍然能促進細胞的增殖，但這種促進作用能被GdCl3抑制，這提示Ihh并非是牽張應變促進成骨細胞增殖的唯一途徑，牽張力還可能通過其他通路或因子促進成骨細胞增殖。

此外，加入Hh通道增強劑N-Shh后，加力組較對照組成骨細胞增殖增加，這也進一步支持了牽張應變促進成骨細胞增殖的傳導通道可能涉及眾多的通路或因子，而Ihh僅僅是其中之一；Hh通道增強劑N-Shh和力學刺激共同作用也并不比單獨力學刺激更能促進成骨細胞增殖。這提示牽張力和N-Shh在促進成骨細胞增殖上并無協同作用。

綜上所述，Ihh參與了牽張力對成骨細胞增殖的調節；Hedgehog通路是參與應力對成骨細胞增殖調控的通道之一。對Hedgehog信號的調控，可能成為促進骨形成和骨修復的又一有效途徑。

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