成骨誘導(dǎo)劑對拔牙創(chuàng)愈合的影響

陳俊良 單春城 何蕓 夏德林

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院 口腔科，重慶402160；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔頜面外科，瀘州646000）

牙拔除后局部牙槽嵴缺乏牙齒的支持和功能性刺激而發(fā)生萎縮、吸收，給牙列修復(fù)和種植治療帶來了牙槽骨骨量不足的問題。學(xué)者們研究出多種預(yù)防牙槽嵴吸收的方法，但由于材料制取復(fù)雜、操作煩瑣、治療效果不穩(wěn)定、費(fèi)用較高等原因未廣泛應(yīng)用于臨床[1]。一定劑量和濃度的地塞米松（10-8mol·L-1）、維生素C（50 mg·L-1）和β-甘油磷酸鈉（10 mmol·L-1）組成的試劑能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）向成骨細(xì)胞方向分化，促進(jìn)新骨形成，被認(rèn)為是經(jīng)典的成骨誘導(dǎo)劑，已廣泛地用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究[2]。將其植入拔牙創(chuàng)后，能否誘導(dǎo)牙槽窩內(nèi)骨的形成，促進(jìn)拔牙創(chuàng)愈合及防止牙槽骨吸收萎縮，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將載有地塞米松、維生素C和β-甘油磷酸鈉的成骨誘導(dǎo)劑的明膠海綿植入拔牙創(chuàng)內(nèi)，觀察牙槽窩內(nèi)新骨的形成及牙槽骨吸收萎縮情況，來尋找一種操作簡捷、價(jià)格適宜、便于臨床廣泛推廣的方法來促進(jìn)拔牙創(chuàng)愈合，減少牙槽嵴的萎縮和吸收。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

3%戊巴比妥鈉、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉（Sigma公司，美國）。吸收性明膠海綿（金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，國藥準(zhǔn)字H3-2024096），在無菌條件下將其剪成0.3 cm×0.3 cm×0.7 cm大小，與拔牙窩相仿，然后浸潤由地塞米松（10-8mol·L-1）、維生素C（50 mg·L-1）和β-甘油磷酸鈉（10 mmol·L-1）組成的成骨誘導(dǎo)劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選用健康雄性家兔50只，體重2.5～3.0 kg，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科分籠飼養(yǎng)。動(dòng)物稱重后，3%戊巴比妥鈉（劑量為30 mg·kg-1）耳緣靜脈注射麻醉，常規(guī)消毒、鋪巾，拔除雙側(cè)上頜第一前磨牙，采用同體對照，右側(cè)拔牙創(chuàng)內(nèi)填入載有成骨誘導(dǎo)劑的明膠海綿，作為實(shí)驗(yàn)側(cè)；左側(cè)拔牙創(chuàng)內(nèi)填入空載明膠海綿，作為對照側(cè)。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素（劑量為每次80萬單位，每天2次）。術(shù)后前3 d半流質(zhì)飲食后普通飼料喂養(yǎng)，以防植入物脫落。分別于術(shù)后第1、2、4、8、12周時(shí)隨機(jī)處死10只動(dòng)物，取雙側(cè)牙槽骨標(biāo)本，行大體觀察測量和X線片檢測后立即于10%中性甲醛中固定，脫鈣組織切片，備用。

1.3 影像學(xué)檢查

術(shù)后1、2、4、8、12周拍攝牙槽骨標(biāo)本X線片，測量各組各時(shí)間段標(biāo)本骨缺損區(qū)的新骨密度，骨密度（bone mineral density，BMD）值以單位象素的灰度值（mean grey value，MGV）表示。采用Kodak 2100口腔X射線機(jī)及RVG 6000數(shù)字成像系統(tǒng)（電壓60 kV，管電流7 mA，曝光時(shí)間為0．1 s），用平行投照法行數(shù)字牙片拍攝。采用Adobe Photoshop CS5軟件測量標(biāo)本數(shù)字X線片牙槽窩對應(yīng)處的灰度值，骨密度越高，越阻射，亮度越高，灰度值即越高，呈對應(yīng)關(guān)系。

1.4 牙槽嵴高度吸收值的測量

測量12周時(shí)牙槽嵴高度吸收值，以第二前磨牙遠(yuǎn)中和第三前磨牙遠(yuǎn)中牙槽嵴頂連線為參考線，測出拔牙處最低點(diǎn)距離該線的垂直距離，即為牙槽嵴高度吸收值。具體方法為：用直尺表示出牙槽嵴頂連線，用帶標(biāo)記的20號擴(kuò)銼針標(biāo)記出拔牙處最低點(diǎn)距牙槽嵴頂連線的距離，用游標(biāo)卡尺測出具體數(shù)值，分別由3人進(jìn)行測量，每人測3次，計(jì)算平均值。

1.5 脫鈣石蠟切片的制作和染色

各組標(biāo)本置于10%中性甲醛中固定，經(jīng)10%硝酸脫鈣，系列脫水，常規(guī)石蠟包埋，近遠(yuǎn)中方向切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光鏡觀察并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對拔牙創(chuàng)區(qū)骨密度和牙槽嵴高度吸收值的測量結(jié)果進(jìn)行配對計(jì)量資料比較的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 骨密度的測量結(jié)果

實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)骨密度的測量結(jié)果見表1。隨著時(shí)間的增長，兩側(cè)拔牙創(chuàng)區(qū)骨密度值均有不同程度的增強(qiáng)。術(shù)后1周，實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)骨密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后2、4、8、12周，同一時(shí)間，實(shí)驗(yàn)側(cè)的骨密度值高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。術(shù)后第8周，實(shí)驗(yàn)側(cè)可見清晰骨小梁影像，拔牙窩骨密度與周圍正常骨密度接近，新生骨與正常骨界限不明顯。對照側(cè)拔牙窩新生骨與正常骨界限明顯（圖1）。

表1 實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)X線片灰度值比較Tab 1 Comparison of MGV between experiment side and control side n=10

圖1 術(shù)后第8周，實(shí)驗(yàn)側(cè)（上）和對照側(cè)（下）的X線片觀察結(jié)果Fig 1 X-ray results of experiment side（up）and control group（down）in 8 weeks

2.2 牙槽嵴高度吸收值的測量結(jié)果

術(shù)后12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)牙槽嵴高度吸收值分別為（1.43±0.08）、（1.87±0.09）mm，實(shí)驗(yàn)側(cè)牙槽嵴高度吸收值小于對照側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 組織學(xué)觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)的組織學(xué)觀察結(jié)果見圖2、3。實(shí)驗(yàn)側(cè)術(shù)后1周即可觀察到成骨細(xì)胞及成骨趨勢，2周時(shí)較明顯；而對照側(cè)2周時(shí)牙槽窩內(nèi)為大量的血細(xì)胞和炎細(xì)胞及部分成纖維細(xì)胞，為新鮮的肉芽組織。4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)牙槽窩已完全為纖維組織所充填，可見成骨細(xì)胞增生活躍。大量骨細(xì)胞被埋入新形成的骨基質(zhì)中，形成骨陷窩，部分區(qū)域已見近似板層狀的類骨質(zhì)形成。對照側(cè)纖維組織成分增多，在結(jié)締組織中僅有點(diǎn)狀骨島形成，成骨現(xiàn)象較少。8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)骨小梁明顯較對照側(cè)粗大成熟。12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)牙槽窩已充滿了成熟的板狀新骨；對照側(cè)新生骨才趨向成熟，部分為板層狀骨。

圖2 實(shí)驗(yàn)側(cè)的組織學(xué)觀察結(jié)果 HE×100Fig 2 The histology results of experiment side HE× 100

圖3 對照側(cè)的組織學(xué)觀察結(jié)果 HE×100Fig 3 The histology results of control group HE×100

3 討論

拔牙創(chuàng)愈合是一個(gè)動(dòng)態(tài)的復(fù)雜過程，是機(jī)體骨組織的一種再生修復(fù)過程[3]。為了促進(jìn)拔牙創(chuàng)愈合和新骨形成，筆者采用在拔牙窩中置入成骨誘導(dǎo)劑的方法，結(jié)果表明效果是明顯的，其機(jī)制可能與下列因素有關(guān)。1）地塞米松是最常用的成骨誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，胰島素樣生長因子-1和膠原mRNA的表達(dá)，刺激細(xì)胞外膠原基質(zhì)的生物合成、鈣的沉積和礦化結(jié)節(jié)的形成[4]。但高濃度地塞米松（10-6mol·L-1）卻會激活細(xì)胞表面的糖皮質(zhì)激素受體，使其向脂肪細(xì)胞分化，抑制BMSCs增殖，從而減少向成骨細(xì)胞分化。一般認(rèn)為地塞米松濃度取10-8～10-10moL·L-1為宜[5]，本實(shí)驗(yàn)采用的地塞米松濃度為10-8moL·L-1。在本實(shí)驗(yàn)中，1周時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)即可見較多成骨細(xì)胞，而對照側(cè)未發(fā)現(xiàn)，應(yīng)該與地塞米松的誘導(dǎo)成骨作用相關(guān)。2）維生素C能促進(jìn)細(xì)胞合成膠原，形成鈣化，同時(shí)調(diào)節(jié)ALP活性。目前認(rèn)為，ALP能夠水解有機(jī)磷酸酶，使局部磷酸鹽濃度升高，并可破壞鈣化抑制劑，從而啟動(dòng)鈣化，促進(jìn)成骨。維生素C與許多生長因子有協(xié)同作用，可增加其他生長因子對細(xì)胞的增殖效應(yīng)[6]。3）β-甘油磷酸鈉可以為成骨細(xì)胞提供磷酸離子，促進(jìn)生理性鈣鹽的沉積和鈣化。3種因子的共同作用，加速了成骨細(xì)胞的分化和增殖，促進(jìn)拔牙創(chuàng)骨形成。

誘導(dǎo)成骨過程的順利完成，一般需要3個(gè)基本條件：骨誘導(dǎo)因子、靶細(xì)胞和良好的局部骨形成環(huán)境。拔牙創(chuàng)有著良好的骨形成生物學(xué)特性和成骨環(huán)境。拔牙創(chuàng)骨壁疏松多孔，血循環(huán)豐富，局部抗感染力強(qiáng)。此外，拔牙窩內(nèi)有較多對骨誘導(dǎo)作用敏感的靶細(xì)胞，它們是余留牙周膜中間充質(zhì)細(xì)胞和經(jīng)血循環(huán)從周圍骨髓腔進(jìn)入拔牙創(chuàng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞[3，7]。明膠海綿作為成骨誘導(dǎo)劑的載體，能很好地維持藥物的局部濃度。同時(shí)它能促進(jìn)血液凝固，使血凝塊內(nèi)的活性物質(zhì)和誘導(dǎo)劑不易散失；纖維蛋白網(wǎng)的存在能夠吸引拔牙創(chuàng)內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞向缺損區(qū)遷移，使其與誘導(dǎo)劑充分接觸，而促進(jìn)這些細(xì)胞的增殖和分化；其特殊的微孔結(jié)構(gòu)能為未分化的間質(zhì)細(xì)胞遷入和新生血管的長入提供良好支架[8]，增加了生長因子和靶細(xì)胞的作用面積，保證了骨組織的再生空間。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：載有成骨誘導(dǎo)劑的明膠海綿置入拔牙創(chuàng)2周后即有新骨生成，成骨細(xì)胞分化與增生較對照側(cè)明顯活躍，在數(shù)量和質(zhì)量上明顯優(yōu)于對照側(cè)。整個(gè)過程中，實(shí)驗(yàn)側(cè)拔牙創(chuàng)內(nèi)成骨現(xiàn)象較對照側(cè)早，成骨細(xì)胞分化和增殖更活躍，新骨形成更快。骨密度測量分析顯示：實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)拔牙創(chuàng)區(qū)骨密度值隨時(shí)間的增長均有不同程度的增強(qiáng)，同一時(shí)間，實(shí)驗(yàn)側(cè)的骨密度值高于對照側(cè)。說明在地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C組成的成骨誘導(dǎo)劑的作用下，加速了成骨細(xì)胞的分化和增殖，從而促進(jìn)成骨。

新骨的快速形成能使拔牙創(chuàng)區(qū)骨質(zhì)承受較大壓力而不發(fā)生變形，也可防止無牙區(qū)牙槽嵴因受壓時(shí)間過長所產(chǎn)生的牙槽骨吸收，從而起到防止牙槽骨高度降低的效果。本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本測量結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)側(cè)牙槽嵴吸收明顯少于對照側(cè)，說明該材料可能有保持牙槽嵴形態(tài)的作用。

地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C作為經(jīng)典的成骨誘導(dǎo)劑，能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化，促進(jìn)新骨形成。將載有成骨誘導(dǎo)劑的明膠海綿植入拔牙窩，能促進(jìn)拔牙創(chuàng)愈合，加速成骨和骨改建，減輕牙槽骨的吸收萎縮。其制取容易、操作簡單、費(fèi)用低廉，易于臨床廣泛推廣。

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