三七組織培養研究綜述

黃 勇，張 鐵，張文生，辛文鋒

（1.文山學院 生化系，云南 文山 663000；2.北京師范大學，北京 100875；3.云南省三七生物技術與制藥工程研究中心文山分中心，云南 文山 663000）

三七 [Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]又名田七，系五加科人參屬植物，享有“金不換”、“南國神草”、“人參之王”等美譽，是我國傳統名貴中藥材。三七味甘、微苦、性溫，具有防治癌癥、抗衰老、抗疲勞、抗炎、降血壓、降血脂等多方面的藥理作用和保健功能，其主要藥理活性成分是皂苷，目前尚不能人工合成。三七對生長條件要求苛刻，全世界僅云南省文山州以及廣西部分地區適宜生長，加之生長周期長、病蟲害嚴重、連作障礙、農藥殘留等問題，市場上三七資源供不應求。通過組織培養技術，既可快速繁殖三七種苗，又可直接生產次生代謝物，是有效解決上述問題的途徑之一。本文將對國內外三七組織培養研究進展做一綜述。

1 愈傷組織誘導

在三七組織培養過程中，不管是進行種苗快速繁殖，還是次生代謝物生產，愈傷組織的誘導是首要的重要步驟，在愈傷組織誘導中，外植體的選擇、激素的種類組合與濃度關系著組織培養效果的好壞甚至成敗。

1.1 外植體選擇

由于細胞具有全能性，故三七各器官均能誘導出愈傷組織，但誘導率差異甚大。因此，篩選出愈傷組織誘導率高的器官作為三七組織培養的外植體至關重要。鄭光植等[1]研究表明：無論生長速率和干重增加、粗皂苷含量和產率、粗皂苷元含量、主要皂苷成分Rg1、Rb1和Rh1及其含量、皂苷組成還是誘導愈傷組織的頻率及速率，都以莖作為外植體誘導的愈傷組織更為優良。高先富等[2]認為幼嫩花蕾愈傷組織是誘導不定根的理想材料。段承俐[3]用花藥作為外植體誘導愈傷組織，取得了較好的效果。由此可見：三七愈傷組織取材廣泛，可根據研究目的選用不同的外植體。一般情況下選用莖作為外植體會取得不錯的效果；用幼嫩花蕾作為外植體有利于不定根的誘導；從事單倍體方面的研究則應選用花藥作為外植體。

1.2 激素選擇

植物生長調節劑又稱植物激素，包括細胞分裂素、生長素等。細胞分裂素和生長素搭配使用可誘導植物脫分化形成愈傷組織，被廣泛應用于植物組織培養。但不同的植物對植物生長調節劑的種類和濃度的反應不盡相同。因此，需要篩選出適合三七愈傷組織誘導的激素組合與濃度。目前，在三七組織培養中，用于愈傷組織誘導的生長素大多使用2，4-D，濃度一般為2 mg·L-1左右；搭配使用一定濃度的細胞分裂素效果更佳，目前大多使用KT，濃度一般為 0.5～0.7 mg·L-1[1-2，4]。

1.3 基本培養基選擇

目前，三七組織培養中，用于愈傷組織誘導的基本培養基主要是MS培養基[1-4]。也有少數研究使用 6，7V[5]。

1.4 培養條件

三七愈傷組織誘導一般是在黑暗條件下進行，光照有一定抑制作用[4-6]，溫度和pH值一般分別為25 ℃和 5.8[1，5，7]。

2 次生代謝物生產

三七與其下游產品的藥效成分主要集中在皂苷，通過組織培養技術可以實現皂苷規模化生產。用植物懸浮細胞培養技術生產次生代謝物質已成為當代生物制藥的一個重要領域；通過誘導愈傷組織、篩選培養條件、選擇優良培養體系和添加合適誘導物質等方法，可以進行細胞原的批量生產，然后分離提取得到代謝產物。這種生產方式得到的次生化合物含量往往比植物體高出2～5倍，而且細胞懸浮培養生產次生代謝物質具有不受各種外界環境的影響、繁殖速度快、培養規模大和提供大量均勻一致植物培養物等優點，適于大規模的工廠化生產。

日本、韓國通過細胞培養、不定根培養已實現了人參皂苷的工廠化生產。而三七在這方面的研究起步較晚，鄭光植等[1，4，6]進行了較為系統的研究，對外植體類型、培養基、培養條件、外源激素、培養基天然補充物等影響因子進行了研究，使三七愈傷組織的生長速率達220 mg·L-1·D-1，愈傷組織中總皂苷含量達13%。侯篙生等[8]用5 L氣升式反應器培養細胞，發現外循環反應器中三七總皂苷含量達9.48%；內循環反應器中三七多糖含量達24%，但三七細胞生長比較緩慢。周立剛等[9]（1992）用10 L的攪拌式發酵罐對三七細胞進行發酵培養，皂苷含量為干重的11.21%，皂苷產率為1513.3 mg·L-1，細胞培養物產率為每月13.58 g干重·L-1，均比懸浮培養高。甘煩遠等[10]研究了人參寡糖素對三七懸浮培養細胞生長的效應，發現人參寡糖素對三七懸浮培養細胞的生長具有明顯的促進作用。

3 不定根與不定芽誘導

根據研究目的的不同，可通過調節培養基中細胞分裂素和生長素的種類和濃度，誘導愈傷組織產生不定根或者不定芽。如果是為了生產次生代謝物，則誘導不定根，進而對不定根進行繼代增殖培養，擴增出大量不定根后從中提取皂苷等次生代謝物；如果是為了獲得組培苗，則誘導不定芽，繼而誘導生根，從而形成完整的組培苗用于栽培或其它研究。

3.1 不定根誘導

人參不定根培養已成功實現了工業化，反應器規模達到10000 kg[11]，而三七在這方面處于起步階段。高先富等[2]研究表明：幼嫩花蕾愈傷組織是誘導不定根的理想材料；IBA誘導不定根的能力最強；采用將不定根連其母體組織一起在液體培養系統中連續培養后再分離的方法較好。淡墨[12]研究了茉莉酸甲酯對三七不定根次生代謝產物的影響，表明茉莉酸甲酯刺激后三七不定根的次生代謝產物與天然三七根更為相似，證明茉莉酸甲酯可以作為三七不定根增加活性次生代謝產物合成的有價值的誘導劑，值得進一步研究。在建立了三七不定根培養體系的基礎上，可用生物反應器進行放大培養，并優化培養條件，最終實現皂苷的工業化生產。

3.2 不定芽誘導與組培苗

劉瑞駒等[13]首次報道了三七胚狀體的發生，并成功誘導出不定芽進而形成完整植株。陳偉榮等[7]對三七試管苗進行了詳細的研究，獲得了大量組培苗。許鴻源等[14-15]使用靈發素誘導莖愈傷組織產生胚狀體取得了較好效果，胚狀體誘導率達90%左右，且約有30%以上的胚狀體能發育成健壯的全苗，用三七葉片作為外植體也取得了與此相當的效果。由此可見：通過誘導愈傷組織產生胚狀體進而分化不定芽可得到三七組培苗，但畸形胚和不完整胚較多、成苗率低。如何獲得更多正常的胚狀體、提高成苗率是需要繼續研究的內容。

4 討論

在三七組織培養領域，由于起步較晚，各項技術還不是很成熟，要得到高皂苷含量和快速生長的愈傷組織，并將其用于細胞培養、不定根培養，實現皂苷生產的工業化，還需要深入研究。如何提高組培苗的成苗率，實現三七種苗的離體快繁也具有重要的研究價值，產生經濟效益。毛狀根具有可以在無激素的培養基上快速生長、擁有親本植物的次生代謝途徑、遺傳穩定、生長迅速等特點，人參、西洋參毛狀根培養技術已比較成熟[16-17]，而三七還未開展毛狀根培養的研究，篩選適宜的發根農桿菌誘導三七產生毛狀根可能是以后研究的熱點。

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［3］段承俐，張智慧，文國松，等.三七花藥培養的研究（Ⅰ）愈傷組織的誘導［J］.云南農業大學學報，2004 （5）：510-513.

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［7］陳偉榮，簡玉瑜.三七試管苗繁殖技術的研究［J］.華南農業大學學報，1992 （3）：69-75.

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