日本血吸蟲鈣連蛋白（Canx）基因克隆與表達＊

唐 正 劉 镕 趙琴平 明珍平 鐘沁萍 蔣明森 董惠芬

武漢大學基礎醫學院人體寄生蟲學教研室，武漢430071；＃通訊作者

目的：鈣連蛋白（Canx）在蛋白質合成中起重要作用，存在于內質網中需Ca2+的凝集素樣分子伴侶蛋白，可與新合成的尚未折疊完全的蛋白質的寡糖鏈結合，防止蛋白質彼此聚集和泛素化，避免折疊不完全的蛋白質離開內質網；同時也可促進其它伴侶蛋白與這些蛋白質結合，使其折疊完全。無論是曼氏血吸蟲還是日本血吸蟲，僅有與Canx相似的鈣結合蛋白的研究報道。本文報道與宿主相關的日本血吸蟲Canx基因的克隆、表達，為研究其功能奠定基礎。方法：提取日本血吸蟲成蟲總RNA，逆轉錄得到cDNA。設計引物用常規PCR法擴增出Canx編碼基因，在設計引物時，切除了含21個氨基酸的信號肽，并加上了BamH I和Xho I酶切位點。PCR產物切膠回收后使用BamH I和Xho I雙酶切，然后使用同樣的酶雙酶切pET-28a質粒。基因和質粒連接后轉化DH5α宿主菌，使用卡那霉素篩選陽性克隆后測序。將測序結果與已發表的序列進行比對，選取序列準確的克隆擴大培養并提取質粒，轉化BL21宿主菌，并以1mM IPTG作為誘導劑誘導表達，收集、純化重組蛋白。結果：PCR產物跑膠后獲得長度為1 880bp左右的Canx基因特異性產物。經酶切、連接、轉化后對DH5α宿主菌做菌液PCR，出現特異性條帶。測序后將菌株轉入BL21誘導表達，SDSPAGE檢測，發現在95KD左右有特異性條帶，比預測的質量大，但經過尿素變性后，大小與預測相當，約72KD。大量表達后收集、純化重組蛋白質。結論：構建了含日本血吸蟲Canx基因的原核表達質粒pET-28a-Canx，并誘導表達、純化了Canx基因的重組蛋白，為深入研究基因的功能奠定了基礎。

＊國家自然科學基金（81273010）