日本血吸蟲角化不良蛋白（DKC1）基因克隆與表達＊

馬 盼 明珍平 劉 镕 趙琴平 鐘沁萍 蔣明森 董惠芬

武漢大學基礎醫學院人體寄生蟲學教研室，武漢430071；＃通訊作者

目的：本課題組前期的研究結果顯示，在宿主因子作用下，日本血吸蟲母胞蚴角化不良蛋白（DKC1）基因呈現差異表達。本研究克隆、表達DKC1基因，為后期研究日本血吸蟲DKC1基因的功能奠定基礎。方法：通過搜尋DKC1基因的完整開放閱讀框（ORF），設計并合成引物，利用PCR技術擴增目的基因片段，雙酶切，并將其與PET-28a（+）載體連接，轉化入DH5a大腸桿菌，經PCR擴增并測序鑒定后，抽提重組質粒，再將其轉化入表達菌BL21大腸桿菌中。PCR鑒定陽性重組克隆后，IPTG誘導表達，SDS-PAGE方法檢測表達結果，收集、純化重組蛋白。結果：通過設計上下游引物經PCR法擴增出約1 400bp的DNA片段；將DKC1與PET-28a（+）質粒分別作BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，二者經粘性末端連接并轉化DH5a大腸桿菌，PCR篩選陽性重組克隆測序表明，DKC1具有一個長度為1 380bp的ORF，編碼460個氨基酸，理論分子量為51kDa，提取的重組質粒PET-28a（+）-DKC1再轉化入BL21，以PCR鑒定獲得陽性克隆后，IPTG誘導重組菌，產物行SDS-PAGE，成功獲得重組蛋白。結論：本研究成功克隆到DKC1基因，并成功構建了重組載體，篩選到重組體，表達獲得重組蛋白，為鑒定其蛋白功能提供了條件。

＊國家自然科學基金（31000956）