亞臨界水法提取紅三葉中的總異黃酮

尹立影，張永忠

(東北農業大學理學院應用化學系，黑龍江 哈爾濱 150030)

紅三葉(Trifoliumpratense)主要活性成分是紅三葉異黃酮。紅三葉中的異黃酮有近40多種[1]，主要的4種異黃酮分別為芒柄花黃素(Formononetin)、雞豆黃素(Biochanin A)、染料木黃酮(Genistein)和黃豆苷元(Daidzein)[2-5]。前兩種異黃酮含量相對較高，據報道紅三葉中芒柄花黃素含量為9. 65 mg·g-1，雞豆黃素含量為10.22 mg·g-1[3]。一般大豆(Glycinemax)中異黃酮含量0.50～1.70 mg·g-1[6]，紅三葉中總異黃酮含量是其他豆科植物的10～30倍[7]，遠高于大豆中大豆異黃酮含量[8]。紅三葉中含有的異黃酮主要以糖苷的形式存在，采摘后由于酶解或水解反應主要以苷元形式存在[9]。紅三葉異黃酮有消炎[10]、抗癌[11]、抗腫瘤[12]、調節人體激素平衡、改善骨質疏松、緩解婦女更年期綜合癥[12]、防治高膽固醇血癥、抗氧化、清除自由基、預防紫外線[13]等作用。紅三葉生長季節長，分布廣泛，產量高，而且重復修剪能刺激紅三葉中異黃酮含量的增加[7]。紅三葉異黃酮可從葉、莖、花中提取，而大豆異黃酮只能從大豆種子中提取。種植大豆需要優質的耕地，而紅三葉對土壤的要求不高，可以不占用糧食資源和優質土地，因此，紅三葉是獲取異黃酮重要的可再生生物資源。

亞臨界水又稱熱液態水、高壓熱水或過熱水[14]。亞臨界水提取法(Subcritical Water Estraction，SWE)是近期國內外較流行的一種提取方法，具有節省提取時間、萃取效率高、對環境友好等優點。其在高熱高壓下處理且不使用酸、堿和催化劑，用水作為溶劑，沒有有機溶劑殘留，能保留提取物不被氧化、活性不被破壞[15]，因此，也被稱為“綠色的處理法”。利用亞臨界水法提取紅三葉中總異黃酮的研究在國內還未見報道，因此，本研究可為紅三葉的工業應用提供價值。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 紅三葉來源于東北農業大學園藝站，室外種植，于花蕾期采全株，將其烘干后用高速萬能粉碎機粉碎(FW型，天津市泰斯特儀器有限公司)。

純品的芒柄花黃素和雞豆黃素由Fluka公司生產，純度99%；高純氮氣，購自北京市亞南氣體有限公司，質量分數為99.999%。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、METTLER TOLEDO AG135型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、LG10-2 4A型高速離心機(上海安亭科學儀器廠)、高壓磁力攪拌反應釜(煙臺高新區科立自控設備研究所)和真空旋轉蒸發器(上海醫械專機廠有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1紫外分光光度法測定紅三葉總異黃酮的含量 依據文獻[16]測定紅三葉總異黃酮的含量，紅三葉異黃酮中主要含有芒柄花黃素和雞豆黃素。取等比例芒柄花黃素和雞豆黃素的混合溶液，用乙醇分別配制成總質量濃度為0、2、4、6、8 μg·mL-1的混合標準溶液，在253.5 nm下測定混合溶液吸光度，并繪制標準曲線。

1.2.2紅三葉總異黃酮得率的計算

1.3紅三葉異黃酮的亞臨界水提取 將采回的紅三葉全株烘干，經高速萬能粉碎機粉碎，過0.45 mm篩備用。準確稱取紅三葉草粉4.000 0 g放入高壓反應釜中，根據液固比例加入所需體積的蒸餾水，通入高純氮氣加壓，磁力攪拌速度為160 r·min-1，進行亞臨界水提取試驗。

在以下4種條件下進行提取試驗：1)在液固比、提取壓力、提取溫度分別為80 mL·g-1、0.8 MPa、120 ℃條件下，選取提取時間10、20、30、40和50 min進行提取試驗；2)在液固比、提取時間、提取壓力分別為80 mL·g-1、20 min、0.8 MPa條件下，選擇提取溫度為100、110、120、130、140 ℃進行提取試驗；3)在提取時間、提取壓力、提取溫度分別為20 min、0.8 MPa、120 ℃條件下，選擇水與紅三葉草粉的液固比為40、50、60、70、80 mL·g-1進行試驗提取；4)在提取時間為20 min、提取溫度為120 ℃、液固比為50 mL·g-1的條件下，選擇壓力為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 MPa進行試驗提取。

提取液用熱水漏斗趁熱過濾，用乙醇定容適量提取液，按參考文獻[16]在波長253.5 nm處測定其吸光度。根據標準曲線回歸方程計算所得提取液中總異黃酮的含量。

2 結果與分析

2.1提取時間對紅三葉總異黃酮提取效果的影響 當提取時間為20～30 min時，異黃酮得率明顯升高，在30 min以后異黃酮得率有下降趨勢。因此，最佳提取時間為20 min(圖1)。

2.2提取溫度對紅三葉總異黃酮提取效果的影響 開始升溫時，異黃酮得率隨溫度的升高而增大，當提取溫度為120 ℃時，異黃酮的得率最高，隨后下降(圖1)。因此，120 ℃為單因素提取的最佳溫度條件。

2.3液固比對紅三葉總異黃酮提取效果的影響 當液固比為50 mL·g-1時，紅三葉總異黃酮的得率最大(圖1)。試驗過程中發現，若液固比過小會有糊底現象發生；若液固比過大，會給后續純化造成一定困難和不必要的能源浪費。因此，最佳液固比為50 mL·g-1。

2.4提取壓力對紅三葉異黃酮提取效果的影響 在1.0～1.4 MPa壓力范圍內，紅三葉總異黃酮提取率隨提取壓力的增大而增大。當壓力為1.4 MPa時，紅三葉總異黃酮提取率最高，而后下降(圖1)。因此，1.4 MPa為最佳提取壓力。

2.5亞臨界水提取紅三葉中總異黃酮的正交試驗 在單因素試驗的基礎上，對影響亞臨界水提取紅三葉中總異黃酮的各因素進行L9(34)正交試驗設計(表1)，得出結果后進行統計分析，確定其工藝的最佳參數。

圖1 提取時間、提取溫度、液固比和提取壓力對異黃酮提取效果的影響Fig.1 Influence of time，tempreture，liquid to solid ratio and pressure on isoflavone extraction

由極差分析結果可以看出，對紅三葉總異黃酮提取效率影響的主要因素依次為B>C>A>D，即溫度影響相對較大，其次為液固比、提取時間和提取壓力。研究得到最佳組合為A1B2C1D2，即15 min、120 ℃、40 mL·g-1、1.4 MPa(表2)。

2.6驗證試驗 取紅三葉草粉4.000 0 g，按照最佳工藝即15 min、120 ℃、40 mL·g-1、1.4 MPa條件進行試驗，總異黃酮得率為33.61 mg·g-1，高于正交試驗中的最大值，表明本試驗所得出的最佳工藝為最佳提取條件。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

表2 L9(34)設計Table 2 L9(34)Designandresultsof L9(34)orthogonal test

3 討論與結論

溫度越高分子運動速度越快，但長時間的高溫可能會導致異黃酮的分解，或者由于紅三葉中蛋白質變性形成的沉淀將原料包裹起來[17]，降低異黃酮的提取率，其具體原因有待于深入研究。加壓提取與傳統的加熱回流提取相比提取效果更好。加壓是液體介質在壓力作用下的傳遞過程，不論提取物質是固體還是液體，都可受到均一的壓力作用。通過升高溫度和壓力，增強溶劑對原料顆粒的穿透能力，從而加速溶劑的擴散，提高浸出速度和浸出率。同時，高壓還能使溶劑在高于沸點的情況下仍保持液態，保證提取過程中溶劑的充分浸潤。在封閉的系統中不增加壓力，溶劑水不會達到較高溫度，就不會產生亞臨界水，所以增大壓力是產生亞臨界水的必要條件[18]。通入高純氮氣加壓可以防止高溫條件下紅三葉異黃酮被氧化。

由單因素試驗和正交試驗結果可得，亞臨界水法提取的較優條件為提取時間15 min、提取溫度120 ℃、液固比40 mL·g-1、提取壓力1.4 MPa，此時紅三葉總異黃酮得率為33.61 mg·g-1。本研究采用目前較常用的亞臨界水提取技術，水作為溶劑，通過溫度、壓力的持續升高使水處于亞臨界狀態[18]，水的極性和黏度都有所降低，從而增大紅三葉總異黃酮在水中的溶解度，且高純氮氣加壓還能夠防止高溫提取過程中異黃酮被氧化[19]，提高總異黃酮提取率。婁冠群等[20]采用亞臨界水法提取香菇(Lentinusedodes)中多糖，王鳳榮等[21]采用亞臨界水法提取大豆胚芽中異黃酮，周麗等[17]采用亞臨界水法提取葛根(Poerarialobato)中異黃酮。但國內利用亞臨界水提取法提取紅三葉總異黃酮的研究尚未見報道，本研究將亞臨界水提取技術應用于紅三葉總異黃酮提取上是科研方面的新探究，對紅三葉總異黃酮的制備具有一定意義。

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