扁蓿豆萌發對干旱脅迫的響應及抗旱性評價

蔡麗艷，李志勇，孫啟忠，李鴻雁，楊玉平，劉 蕾

(1.中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010； 2.內蒙古農業大學生態環境學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

我國干旱、半干旱面積占國土面積的52.5%[1]，是世界上最干旱的國家之一，特別是北方水資源相對匱乏，干旱已成為發展農業和畜牧業的主要限制因素[2-3]。提高植物的抗旱能力已經成為現代植物研究中急需解決的關鍵問題之一，種子萌發是植物生活史中的關鍵階段，也是進行植物抗旱性研究的一個重要時期。由于植物抗旱性是一個受多種因素影響的數量性狀，應采用多個指標進行綜合評價才更具有可行性和可靠性。

扁蓿豆(Medicagoruthenica)是我國北方地區不可或缺的優質蛋白質飼料之一，其生態適應性廣，生態幅較寬，生態類型多樣，在草地改良、生態治理及草產業開發等多種領域極具潛力。有研究表明，扁蓿豆葉片具有一定的旱生解剖結構[4]，其種子萌發期的抗旱性高于黃花苜蓿(M.falcata)[5-6]，但采用多個指標對其萌發期的抗旱性進行綜合評價的研究較少。利用PEG高滲溶液模擬干旱脅迫已經成為植物抗旱性研究的重要手段[7-9]，在玉米(Zeamays)[10]、水稻(Oryzasativa)[11]、花生(Arachishypogaea)[12]、燕麥(Avenanuda)[3]、油菜(Brassicanapus)[13]、苜蓿(M.sativa)[14]、針茅(Stipaspp.)[15]、煙草(Nicotianaspp.)[16]等植物萌發期的抗旱性研究中已使用。本試驗采用不同濃度的PEG-6000溶液模擬脅迫，對扁蓿豆種質資源進行萌發期抗旱性綜合評價，以明確各供試材料對干旱脅迫的響應能力，為扁蓿豆種質資源萌發期耐旱性鑒定提供理論依據和生產實踐指導。

1 材料與方法

1.1試驗材料 供試扁蓿豆材料均由中國農業科學院草原研究所國家牧草種質中期庫提供(表1)，種子均在2006年采收，4 ℃低溫保存。

1.2試驗方法

1.2.1水分脅迫 種子發芽試驗采用紙上培養法，于2012年3月15日開始在E/PGC系列進入式植物培養箱(型號PGC6L)中進行，挑選飽滿、一致的扁蓿豆種子置于鋪有兩層濾紙的、直徑為9 cm的培養皿中進行培養。每個培養皿50粒種子，每個處理3個重復。以蒸餾水為對照，在培養皿中分別加入5 mL由蒸餾水配置的10%、15%、20%和25%的PEG-6000溶液。根據Michel和Kaufmann[17]的公式得出對應的滲透勢分別為-0.177、-0.393、-0.735和-1.25 MPa。

表1 試驗材料及來源Table 1 Germplasm materials and their collection places

不同質量分數的PEG-6000對應的滲透勢公式為：

ΨS=-(1.18×10-2)C-(1.18×10-4)C2+(2.67×10-4)CT+(8.39×10-7)C2T。

式中，ΨS為溶液的水勢(bar)，C為PEG-6000的質量分數，T為溫度(℃)。

1.2.2種子萌發試驗 在25 ℃和相對濕度60%的恒定條件下，連續黑暗培養11 d。以胚根與種子等長、胚芽長度為種子長度1/2時為發芽標準，每天定時記錄種子發芽數并用電子天平稱量補充水分。每4 d更換一次濾紙，以盡量減少水勢變動。發芽結束后分別測量芽長、根長和幼苗干質量。

發芽指數=Gt/Dt。

式中，Gt為在第t天的發芽數，Dt為相應的發芽天數。

活力指數=發芽指數×幼苗干質量[18]。

1.2.3抗旱性綜合評價方法 用隸屬函數法對扁蓿豆材料萌發期抗旱性進行綜合評價。先利用公式Xu=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)計算每份材料相對發芽率、相對發芽勢、相對幼苗干質量、相對發芽指數、相對活力指數的具體隸屬函數值。式中，Xu為參試植物某一抗旱指標的測定值，Xmax和Xmin分別為所有材料中該指標的最大值和最小值，最后把每份材料各項指標隸屬函數值累加，取其平均值，根據各材料平均隸屬函數值大小確定其抗旱性強弱。平均值越大，抗旱性越強；反之，抗旱性越弱[19]。

1.3數據統計與分析 采用Excel 2003整理，SAS 9.0統計分析試驗數據。采用單因素方差分析法和最小顯著差異法比較不同數據組間的差異；利用NTSYSpc 2.1軟件，采用最短距離法進行聚類分析；采用隸屬函數法對扁蓿豆種質資源進行萌發期抗旱性綜合評價。

2 結果與分析

2.1干旱脅迫對扁蓿豆種子發芽特性的影響 對照條件下，6份扁蓿豆材料種子的發芽率為91.33%～98.67%，且材料間沒有顯著差異(P>0.05)。隨著干旱脅迫的加劇，發芽率有所不同(圖1)，在15%PEG脅迫下02972的發芽率為64.67%，其余材料均小于50%，可以看出在輕度PEG脅迫下(濃度0～15%)，02972具有較強的萌發抗旱特性。PEG濃度為20%時，02972和03056的發芽率小于10%，未萌發的種子均失去了發芽能力，說明此濃度為這兩份材料的極限致死濃度，其他4份材料發芽率均大于10%且差異不顯著(P>0.05)。PEG濃度達到25%時，09288的發芽率為17.33%，顯著高于其他5份材料(P<0.05)，說明09288與其他5份材料相比，對干旱脅迫的敏感性較弱，體現出較強的萌發抗旱特性。

PEG干旱脅迫對扁蓿豆種子發芽勢的影響顯著，種子發芽勢的變化趨勢較發芽率的變化明顯(圖2)。PEG濃度為10%時，所有供試材料的發芽勢均低于51%，03056和02972顯著高于其他4種材料(P<0.05)；當PEG濃度達到20%時，發芽勢均接近0，即發芽前5 d所有材料的種子幾乎均未發芽，說明隨著PEG脅迫加劇種子的發芽整齊度明顯降低。

圖1 扁蓿豆種質材料在不同PEG-6000濃度下的發芽率Fig.1 Seed germination rates of Medicago ruthenica under different PEG-6000 stress

圖2 扁蓿豆種質材料在不同PEG-6000濃度下的發芽勢Fig.2 Seed germination potential of Medicago ruthenica under different PEG-6000 stress

隨著PEG濃度加大，6份扁蓿豆材料種子的發芽指數急劇下降，當濃度為10%時，發芽率為60.61%～86.00%，但發芽指數均不足對照的1/2(圖3)，表明該濃度下雖然種子具有較高的發芽能力，但其已經發生劣變，種子活力已經顯著下降。

PEG濃度為0～15%時，03056的種子活力指數與其他材料相比，處于較高水平，顯著高于02988和02956(P<0.05)(圖4)；隨著PEG濃度的進一步加大，來源于荒漠草原的02982和02988表現出較好的抗旱性。

圖3 扁蓿豆種質材料在不同PEG-6000濃度下的發芽指數Fig.3 Seed germination index of Medicago ruthenica under different PEG-6000 stress

圖4 扁蓿豆種質材料在不同PEG-6000濃度下的活力指數Fig.4 Seed vigor index of Medicago ruthenica under different PEG-6000 stress

2.2干旱脅迫對扁蓿豆幼苗生長的影響 幼苗的芽長和根系生長對干旱脅迫的響應相似，6份扁蓿豆種質材料種子的芽長和根長均隨干旱脅迫的加劇而下降，但變化幅度有所不同。方差分析表明(表2)，芽長在所有處理中均表現出顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)。隨著PEG濃度加大，扁蓿豆的芽長急劇下降，各材料間的差異也逐漸加大。在PEG濃度為15%時，根長與其他處理間呈極顯著差異(P<0.01)，此時根系的生長被顯著抑制，且材料間的差異也加大(變異系數為0.394 9)，說明該濃度可作為扁蓿豆種子萌發期抗旱性鑒定的最佳濃度。

隨著PEG濃度增加，幼苗的芽長和根長都在減小，但根長/芽長的值逐漸增加，PEG濃度為20%和25%時，近一半幼苗的胚芽不再生長，因此沒有測出根長/芽長的值。這表明與根長相比，芽長受到干旱脅迫時的響應更為明顯。PEG濃度為15%時，根長/芽長的均值為2.568 2，不同材料間呈極顯著差異(P<0.01)，此時的變異系數為0.450 8，較對照和10% PEG下都高。因此，就芽長/根長這一性狀來說，15% PEG濃度可作為扁蓿豆萌發期抗旱性鑒定的最佳濃度。6份扁蓿豆材料幼苗的干質量均隨著PEG濃度加大而降低，但不同處理下各材料間差異未達到顯著水平(P>0.05)，在PEG濃度為0、10%和15%時，03056的干質量均較大；就幼苗干質量的整體下降速度而言，03056下降較快，而02988在6份材料中最為緩慢，所以02988萌發期的抗旱性強于其他材料。

表2 扁蓿豆種質材料在不同PEG-6000濃度下芽長、根長和幼苗干質量的差異Table 2 The bud and root length, and dry weight of Medicago ruthenica seedlings under different PEG-6000 stress

2.3扁蓿豆種質材料的抗旱性綜合評價 用模糊函數隸屬法對6份扁蓿豆種質材料相對發芽率、相對發芽勢、相對幼苗干質量、相對發芽指數和相對活力指數進行綜合評價，得到6份扁蓿豆材料的隸屬函數總平均值，并根據均值的大小進行排序(表3)。得出6份扁蓿豆材料抗旱性隸屬函數總平均值范圍為0.444 4～0.521 7，其中02972、03056和02988種子萌發期的抗旱性較強，而02982的抗旱性最弱。

結合以上各測定指標，采用最短距離法，將供試的6份扁蓿豆材料進行聚類分析(圖5)，當閾值為0.024時，可以把6份材料分為4類。其中來源于典型草原的02920、02956和來源于荒漠草原02982聚為一類，通過抗旱性綜合分析發現，這3份種質的萌發抗旱性均較弱；來源于荒漠草原的02988、03056和來源于典型草原的02972各自為一類，其中02972與其他5份材料的遺傳距離較大。

表3 耐旱指標隸屬值及耐旱性綜合評價Table 3 Subordinate function values of drought resistances and comprehensive evaluation of six germplasm materials of Medicago ruthenica

3 討論與結論

牧草種子萌發和幼苗階段的抗逆性強弱是影響草地建植成敗的關鍵[20]。在種子萌發和幼苗生長階段，對土壤水分和溫度的變化較敏感，隨著牧草生長，其抗旱能力逐漸增強。因此,研究扁蓿豆材料在這兩個時期的抗旱性對生產實踐具有重要的指導意義。利用PEG-6000模擬干旱水分脅迫，以評價和鑒定不同材料種子發芽階段的耐旱性是一種比較可靠的方法[21-23]。種子發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數作為植物種子在水分脅迫下的耐旱指標，能反映植物種子發芽速度、發芽整齊度和幼苗健壯的趨勢，因此，常用于了解不同材料在水分脅迫下的抗旱性程度。本研究利用PEG-6000模擬干旱脅迫對6份扁蓿豆種質材料種子萌發的差異性來反映它們的抗旱能力的大小。6份扁蓿豆材料的種子發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、芽長、根長及幼苗干質量基本上都隨脅迫程度的加劇呈下降趨勢。根長與芽長的比值則隨著PEG干旱脅迫的加劇而增大，當PEG濃度達到20%時，只有胚根生長，而胚芽不再生長，這可能是由于水分脅迫下，植物吸收的營養物質優先供給地下器官(胚根)，促進幼苗成活和生長，以適應外界不良環境[24]。

以不同指標為依據，測定各材料的抗旱性順序并不完全一致，不同材料對某個指標的耐旱性不盡相同，單一指標難以綜合反映供試材料的抗旱性強弱[25-26]。因此，本研究利用聚類分析法和模糊數學中的隸屬函數法對發芽率、發芽勢、幼苗干質量、發芽指數及活力指數等多指標進行綜合評價以避免單因素評定的差異，力爭全面反映扁蓿豆種質資源的抗旱性。結果顯示，6份扁蓿豆種質資源中，來源于通遼市大青溝自然保護區的02972號材料在種子萌發期的抗旱性最強，來源于包頭市土默特右旗的03056和02988號材料的抗旱性較強，這3份種質在幼苗及成株階段的抗旱性如何，我們將繼續觀測，為選育優異的扁蓿豆抗旱材料奠定基礎；來自錫林郭勒盟的02920和02956及呼和浩特市武川縣的02982抗旱性較弱。

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