桔梗不育特性及育性穩定性研究

劉自剛，呼天明，汪玉琳，王新軍，楊亞麗，張 雁，何 軍，雷燕妮

(1.商洛學院生物醫藥工程系，陜西 商洛 726000；2.西北農林科技大學動物科學學院，陜西 楊凌 712100)

桔梗(Platycodongrandiflorum)為桔?？平酃?，是一種藥、食、賞兼用的多年生雙子葉草本植物。豐富的種質資源是進行遺傳研究和種質改良的物質基礎，具有特異性狀桔梗種質的鑒定及其遺傳信息的占有是科學開展良種培育的前提，隨著桔梗種質觀察研究的不斷深入，一些新的種質類型不斷被發現[1]。

在高等植物中雄性不育是一種很普遍的遺傳現象，到目前為止已在43科162屬297種中發現了雄性不育的存在[2-6]。植物雄性不育性是特殊的育種目標性狀，通過雄性不育系進行雜交制種利用雜種優勢已成為許多異花乃至自花授粉植物的主要育種方向[7-8]。目前對桔梗雄性不育的相關報道較少，僅有魏建和[9]、吳日基等[10]、王志芬等[11]、劉自剛等[12]各自在不同群體中先后發現并鑒定了桔梗雄性不育突變體并對其進行了初步研究，魏建和[9]還對桔梗雄性不育發生的細胞學機理、遺傳特性等進行了初步探討，但尚未見桔梗雄性不育穩定性方面的相關報道。本研究對桔梗不育種質從生殖結實特性、育性穩定性等方面進行研究，以期為桔梗育性特異種質的進一步發掘和雜種優勢利用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 2006年7月在進行桔梗去雄雜交、套袋自交的過程中，在當地生長2年的桔梗栽培群體中發現了1株雄性不育單株。隨后在種質資源圃及大田中，對桔?；ㄆ餍螒B結構展開了大量的田間觀察和花粉活力的鑒定，又相繼發現了桔梗不育材料14株，并編號為PA1～PA14。PF、PCF、ZB分別為商洛、赤峰、淄博栽培種中篩選的可育單株。

1.2方法

1.2.1不育花形態結構及傳粉生物學研究 對不育花花器結構、柱頭運動、單花花粉量、胚珠數、不育花結實率，不育株系開花物候期，傳粉昆蟲的種類和行為進行統計觀察；胚珠活性采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)測定，花粉活力采用I2-KI 染色法測定，不育花結實特性采用人工授粉法，授粉后套袋掛牌標記，成熟后統計結果率和結籽率，以衡量柱頭壽命。

單花花粉量測定方法：分別隨機選取即將開放的花蕾(花藥未開裂)各10朵，每株采1朵，固定于FAA中，帶回實驗室備用。從花中取下花藥，用1.0 mL·L-1HCl軟化花粉壁。然后細心的解剖花藥，將花粉全部移入1個有刻度的離心管，用蒸餾水定容至4 mL。在振蕩器上震蕩2 min后，用移液槍吸取1 μL的花粉液于載玻片上，在顯微鏡下觀察并統計花粉數，每個花藥重復5次；花粉/胚珠比率(P/O)用其花藥中的花粉數除以其子房中的胚珠數得出。

1.2.2不育株結實率鑒定 于花期對篩選的12個不育單株材料，分別進行人工授粉、套袋自交和自然授粉3種處理，并掛牌標記，處理后10 d除去套袋；在研究中發現桔梗具有自交不親性，且主要由雌雄蕊異熟和花后柱頭絨毛隔離花粉造成的。因此，采用延遲授粉的方式進行人工授粉，即花前1 d套袋，套袋后3 d再人工授以新鮮花粉；種子成熟后統計結實率、結籽率。

1.2.3桔梗不育性對溫度的反應 將同一不育株材料的無性繁殖后代單株，分別培養于相同規格的兩個培養盆中，花芽分化期將一盆放置于人工氣候箱內，設置箱內溫度比同期室外溫度低4～6 ℃；另一盆放置于室外自然環境，保持室內外溫差在開花后進行育性鑒定。

1.2.4桔梗不育性對光照的反應 盆栽采用植盆規格為25 cm×20 cm、裝土量及盆土養分一致。材料為敗育徹底單株PA14的無性繁殖后代；光照長度控制采用遮光處理縮短光長、人工補光延長光長，中斷暗期處理在人工氣候箱中進行。于花芽分化期進行光照處理，暗棚遮光(雙層黑布罩)處理設3個日長，分別為9、12和15 h·d-1；中斷暗期處理為每天00：00人工光照1 h。開花后鑒定不育性變化情況。

1.2.5環境對桔梗不育性的影響 選用桔梗雄性不育株的無性繁殖后代分別在3個不同緯度的地區(云南昆明、陜西商洛、山西代縣)定植，于花期觀察育性表現，統計花粉量、花粉敗育率。

1.2.6主要營養元素對桔梗育性的影響 將桔梗不育株系分別定植于紅壤、沙質土、黃土3種不同質地土壤中，土壤肥力情況見表1。于花期觀察育性表現，統計花粉量、花粉敗育率。

表1 不同土壤類型的化學性狀

1.2.7不育性遺傳特性研究 用不育材料和來源不同的桔?？捎龁沃杲M配，于花期調查花期觀察育性表現，并調查不育株數，計算不育株率，統計育性表現情況。

1.3數據分析 利用SPSS軟件和Excel對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1桔梗不育花形態結構及生殖特性研究

2.1.1花形態特征 桔梗不育花花冠大小、花瓣顏色、子房大小與相同來源的可育花相比沒有明顯差異；但不育花柱頭比可育花略大，色澤也較深為藍色，柱頭外被白色絨毛，無或少有花粉附著；花藥干癟萎縮為灰褐色，與柱頭相離，寬僅為可育花花藥的1/3，長為2/3左右(圖1)。

圖1 桔梗不育花、正?；?、正常花粉及典敗花粉形態

2.1.2花粉量、胚珠數和花粉胚珠活性 桔梗可育花單花花粉量為146 880，胚珠數197.6枚，P/O較高，為743.3(表2)；可育花粉經I2-KI 染色均勻且為褐色，花粉粒正五邊形或正六邊形；胚珠與TTC反應被染成深紅色，具有較高活性。桔梗不育單株PA1、PA3、PA4、PA5、PA6、PA7、PA9 和PA11有微量花粉產生，染色鏡檢后發現花粉外形呈不規則狀，不能被I2-KI 染色，為敗育花粉，其余不育單株花藥中無花粉產生；不育花單花平均有胚珠203.4枚，比可育花略多，發育正常，且活性與可育花胚珠相當。

表2 桔梗不育花和可育花單花花粉量、胚珠數比較

2.1.3不育花結實率 桔梗不育花與正?；ó惢ㄊ诜酆妥曰ㄊ诜劢Y果率、結籽率和親和指數均較高，不育花與相同來源的可育花在結實性上無明顯差異；不育花自交不能結籽，桔梗不育花花粉無授粉活力，表明不育花雌蕊正常可育而雄蕊不育，發現的桔梗不育單株確為雄性不育突變材料(表3)。

另外，自花授粉和異花授粉兩種處理，均選用開花后3 d已開裂柱頭授以自花花粉(同一植株花朵花粉)或異花花粉(不同植株花朵花粉)的方法，研究結果顯示，桔梗自交和異交結籽率、親和指數均較高，兩種授粉方式在結實能力方面無明顯差異(表3)，表明延遲3 d授粉是克服桔梗人工授粉結實率低的有效途徑。

2.2桔梗雄性不育穩定性研究

2.2.1栽培地對不育性穩定性的影響 選用同一桔梗雄性不育株的無性繁殖后代、可育單株PCF1、PCF2分別在3個不同緯度的地區(云南昆明、陜西商洛、山西代縣)定植，于花期統計育性表現(表4)。桔梗不育單株PA4敗育徹底，在不同栽培地不育性表現穩定；不育株PA5在不同栽培地花粉量略有所變化，表明桔梗徹底敗育單株不育性很少受環境影響，而微量花粉單株其花粉量在一定范圍內受環境的修飾。

表3 桔梗不育花與可育花結實比較

表4 不同栽培地對不育性穩定性的影響

表5 不同土壤肥力對育性表現的影響

2.2.2土壤肥力對不育性穩定性的影響 不同類型的土壤肥力各指標均不相同，其中以紅壤肥力較高，沙質土肥力中等，黃土肥力最低(表1)。將同一桔梗單株的無性繁殖后代栽培于化學性狀不同的土壤中，在不同土壤肥力栽培條件下，桔梗不育株和可育株單花花粉量均無明顯變化(表5)。表明土壤肥力對桔梗不育株花粉量的形成無明顯影響，土壤肥力對桔梗不育穩定性無明顯作用。

2.2.3不育性在年際間的表現 在商洛地區2006-2008年對桔梗徹底敗育單株PA4和微量花粉單株PA5進行連續3年的育性調查統計結果表明，不育單株PA4在2006-2008年單花花粉量均為0，不育性年際間表現較為穩定；PA5在不同年份單花均產生微量花粉，單花花粉量在年際間略有變化(表6)。

2.2.4溫度對桔梗不育穩定性的影響 在自然溫度條件下，桔梗單株PA2花藥干枯癟小，花藥中無花粉量產生，而在低溫條件下，花藥外形略有增大，產生少量敗育花粉；微粉單株PA13在低溫條件下花粉量有所增加，而且產生少量的可育花粉(表7)。表明在低溫條件下桔梗微量花粉單株其花粉量有明顯增加，而溫度對桔梗徹底敗育單株育性影響較小。

表6 桔梗育性年際間的表現

表7 溫度對育性表現的影響

2.2.5光照對桔梗不育穩定性的影響 9、15 h光照處理下PA14產生極少敗育花粉，12 h和中斷暗期處理條件下PA14未見花粉形成(表8)，表明光照長度對桔梗不育性表現無明顯影響。

表8 光照長度對育性表現的影響

2.3桔梗雄性不育性遺傳特性研究 PA2、PA4為商洛栽培居群中篩選鑒定出的敗育單株，FA1～16為商州栽培居群中篩選的可育單株，PF2、PF3、PF5分別為唐塬、丹鳳、洛南栽培種篩選出的可育單株；ZB1和ZB2為淄博栽培種中篩選的可育單株，2007年以不育株為母本、可育株為父本配置組合。不育株PA2、PA4與來源相同的可育株之間的組合后代，除了PA2×PF3組合后代出現5%左右的可育株外，其余組合后代均不育；而PA4與源于淄博的兩個可育單株的組配后代均表現可育(表9)。表明在商洛栽培種中存在不育材料PA2、PA4的保持基因，而在淄博栽培種中存在不育材料的恢復基因。

表9 不育性株后代的育性表現

3 討論與結論

自然條件下，高等植物群體中出現雄性不育突變體是一種較為普遍的現象。桔梗不育種質在吉林[10]、山東[11]等地已有發現。本研究在2006年桔?；ㄆ谄陂g，在當地桔梗群體中發現桔梗雄性不育單株12個，并用22份來源不同的桔梗可育材料給其授粉，5個測交后代不育株率在95%以上，表明桔梗不育突變材料可以穩定保存。對不育突變單株花粉、柱頭、胚珠活性以及結實特性進行了研究，結果顯示不育花無花粉或有微量敗育花粉，而柱頭、胚珠發育正常，田間授粉結籽率與相同來源的正?；o明顯差異，這與吳基日等[10]、王志芬等[11]的研究結果一致。新桔梗雄性不育突變體的發現拓寬了不育種質的遺傳基礎，并為桔梗雜種優勢利用提供了物質材料。

植物性狀表現受基因的控制，同時也或多或少地受到其生長環境的影響，性狀表現是基因活動及其環境作用的總結果。魏建和[9]在不同桔梗種群中篩選出了雄性不育突變材料共15個單株，對其測交后代的遺傳分析結果表明，這些不育材料分屬兩種不育類型，即核不育型和胞質不育型。這與本研究發現的桔梗不育材料的敗育類型有所不同，對不育株組配的交配后代分析表明，雄性不育材料很可能為核質互作不育型，這為通過雄性不育性利用桔梗雜種優勢提供了更為豐富的遺傳材料。另外，對桔梗不育材料育性穩定性進行了研究，表明桔梗徹底敗育單株在不同光照、不同溫度、不同營養條件以及不同地域栽培等環境因子對其育性影響較小，而“微粉單株”花粉量變化在一定范圍內受到環境的修飾。這一結果對新發現和鑒定的桔梗不育材料的評價提供依據，可為桔梗不育材料的利用途徑及桔梗不育系選育策略的確定、親本繁育及桔梗雜交種制種策略的制定、桔梗雜種優勢利用潛在的經濟風險評估提供理論依據。

植物雜種優勢利用的途徑主要是根據植物開花習性、花器特征、授粉繁殖方式以及特殊突變體材料特點等因素制定[13]。桔梗屬常異花授粉植物，主要采用種子繁殖，但其藥用部位為生長2年的根條，根據這一特點，通過質核互作不育性利用桔梗雜種優勢的途徑可設計為：不育系、保持系和強優系。通過不育系×強優系制備雜交種，這一模式和傳統作物“三系”制種的不同在于傳統作物獲取種子為生產目的；通過不育系×恢復系生產的雜交種必須可育，而通過強優系制備的F1桔梗雜交種只要求根部產量，對于F1的育性沒有要求。如果應用于生產的F1雜交種是不育的，那么制種父本則不適合再稱為“恢復系”，同時為了與自交系相區別，將這種制種父本稱為“強優系”。

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