不同測定方法對青貯飼料中NDF和ADF含量的影響

王曉娜，徐春城，溫定英，陶 雅，孫啟忠，韓海波

(1.中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081；3.中國農業大學工學院，北京 100093; 4.內蒙古草原勘察規劃院，內蒙古 呼和浩特 010051)

青貯飼料作為現代畜禽最主要的粗飼料來源，在畜牧業的發展中愈來愈受到養殖戶的重視，畜禽日糧營養價值的高低與其纖維性物質含量高低密切相關[1-3]，按Van Soest[4]提出的洗滌纖維分析方法，飼料中的中性洗滌纖維(Neutral Detergent Fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid Detergent Fiber,ADF)可以替代傳統的粗纖維，較準確地反映纖維的實際含量。根據薛紅楓和孟慶翔[5]的分析，由于日糧中大部分NDF來源于飼草，粗飼料來源的NDF有效性平均相當于非粗飼料來源NDF的2倍，粗飼料的NDF對家畜生產性能的發揮至關重要。ADF雖然不能做為飼料纖維的評價指標，但是它為木質素的測定奠定了基礎，與飼料營養物質的消化率有較強的相關關系，且在評價飼料有效能值的過程中使用廣泛[6-8]。所以，準確快速地測定青貯飼料中NDF和ADF含量對于青貯飼料質量評價和畜牧業的發展起著舉足輕重的作用。

目前，國際上普遍采用Van Soest飼草分析法，其中，ADF的分析方法已被AOAC收錄(AOAC973.18)，但Van Soest法測定NDF的方法未被AOAC收錄[9]，這主要由于在測定NDF時，中性洗滌劑提取淀粉不徹底，尚有一定數量淀粉殘留在洗滌后的殘渣中，降低了NDF的準確性[10]。但通過在洗滌劑中添加一定量的耐高溫α-淀粉酶，可使這個問題得以解決[11-12]，因為耐高溫α-淀粉酶是一種內切淀粉酶，能隨機水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的α-1，4淀粉葡萄糖糖苷鍵，酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速降低，變成液化淀粉，水解生成糊精及少量葡萄糖和麥芽糖，進而增加飼料中NDF 測定結果的準確性。目前，實驗室一般采用范氏洗滌法對飼料中的ADF進行測定，此種方法在測定時需要重新稱取樣品，測定過程中還需要保持濾器質量不變。習慣上認為，NDF相當于纖維素、半纖維素和木質素，而ADF則相當于纖維素和木質素[13]，由于NDF和ADF僅相差一種物質，所以可以考慮采用連續洗滌法對青貯飼料的ADF進行測定，這樣不僅減少了實驗的繁瑣步驟，而且有效提高測定的效率。對于粗飼料ADF的測定，國內大部分研究均采用傳統的范氏洗滌法[14-17]，薛紅楓和孟慶翔[12]在試驗中使用連續洗滌法對粗飼料ADF進行測定，并證明了此法的可行性。國內對飼料中NDF和ADF測定過程中所使用的濾器做了大量的研究，實驗室一般使用的熱抽濾裝置主要有玻璃坩堝、ANKOM濾袋、CAU濾袋等[18-20]。

為了準確快速有效地評價青貯飼料纖維價值，本研究采用酶處理法測定不同青貯飼料的NDF，連續洗滌法測定ADF含量，并就3種濾器對青貯飼料NDF和ADF的影響進行比較，以期為測定青貯飼料NDF和ADF含量提供可行性依據。

1 材料與方法

1.1樣品的選取與制備 選取采集自內蒙古的8種不同青貯飼料，分別為全株玉米(Zeamays)青貯、干玉米秸青貯、青玉米秸青貯、甜菜(Betavulgaris)青貯、苜蓿(Medicagostiva)青貯、直穗鵝觀草(Roegneriaturzaninovii)青貯、尖葉胡枝子(Lespedezahedysaroides)青貯和全混合日糧(Total Mixed Ration,TMR)青貯(組成TMR日糧后青貯)。對青貯樣品采用四分法，縮分至200 g，粉碎后過0.425 mm分析篩，樣品待用。

1.2儀器與試劑 本試驗選取的濾器為玻璃坩堝 (型號為P2，砂芯孔徑40～60 μm)、ANKOM F57(30 μm)濾袋、CAU(20 μm)濾袋以及配套的封口機，纖維半自動測定儀，燒杯，FOSS纖維測定儀。

耐高溫α-淀粉酶(α-Amylase,heat-stable)由美國Sigma公司提供，型號為A3306，推薦用量為每樣品0.1 mL。

中性洗滌劑：稱取18.61 g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，化學純)和6.81 g四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O)同時放入1 000 mL燒杯中，加少量水加熱溶解后，再加30 g十二烷基硫酸鈉和10 mL乙二醇乙醚。稱取4.65 g無水磷酸氫二鈉，放在另一燒杯中，加少量水，微微加熱溶解后傾入第1個燒杯中，稀釋至1 000 mL，此溶液pH值范圍為6.9～7.0。

酸性洗滌劑：稱取20 g十六烷基三甲基溴化銨，溶于1 000 mL已標定過的0.5 mol·L-1硫酸溶液中，攪動溶解。

1.3實驗步驟

NDF測定：稱取1 g(準確到1/10 000 g)樣品裝入已恒重的ANKOM F57濾袋、CAU濾袋中，封緊袋口，每個樣品設3個重復，每種濾袋設3個空白，將空白組和處理組分別放入3 000 mL的燒杯，每個燒杯放20個濾袋，按每個濾袋100 mL中性洗滌劑和0.5 g無水亞硫酸鈉加入燒杯，處理組每樣另外加入100 μL耐高溫α-淀粉酶。將置有冰袋的蒸發皿放在燒杯上口，將燒杯置于電熱板上，在5～10 min內煮沸，并持續保持微沸1 h。在整個煮沸過程中，每隔10 min用玻璃棒輕輕攪動并在燒杯壁上擠出各濾袋內的溶液，以保證中性洗滌劑充分作用于袋內樣品。煮沸完畢后，離火冷卻10 min，用玻璃棒將濾袋夾出并放入另一燒杯，倒掉廢液。然后用沸水少量多次反復洗滌,在洗滌過程中，要用玻璃棒擠壓濾袋，以使洗滌完全。并用pH試紙檢測，直至濾液顯示為中性，擠干余水，用20 mL(20 mL·袋-1)丙酮沖洗2次，擠干袋內丙酮，置于105 ℃的烘箱中烘3 h，然后取出放入干燥器中冷卻30 min，稱量，直至質量不變，并記錄數據。P2型玻璃坩堝按照FOSS儀儀器說明測定青貯飼料中NDF含量。

ADF測定：對照組按范氏洗滌法步驟進行，即與NDF對照組的測定步驟相同，只是不添加無水亞硫酸鈉。處理組按Goering和Van Soest[21]的連續洗滌法對不同青貯飼料中ADF的含量進行測定，即用裝有NDF殘渣的3種濾器繼續進行酸性洗滌處理。

1.4數據分析 采用SAS學生版8.0軟件中的ANOVA程序對數據進行方差分析和多重比較。

2 結果

2.1洗滌劑對3種濾器質量的影響 各種濾器直接經中性洗滌劑和酸性洗滌劑處理后，質量雖有增減，但是變化幅度很小(表1)，平均失重率的絕對值都小于1%。經過添加耐高溫α-淀粉酶的中性洗滌劑以及連續洗滌法對3種濾器做空白處理后，3種濾器質量均未受到顯著影響。因此，使用3種濾器測定青貯飼料中NDF和ADF時，可以不考慮濾器質量的變化對結果產生的影響。

2.2耐高溫α-淀粉酶對青貯飼料NDF含量的影響 與對照所測青貯飼料NDF結果相比，在中性洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶對不同種類青貯飼料的NDF影響不同，但是大都存在減小的趨勢，其中全株玉米青貯和TMR青貯飼料在添加耐高溫α-淀粉酶后NDF含量顯著減小(P<0.05)，尤以TMR青貯飼料變化最為顯著(表2)；耐高溫α-淀粉酶對其他青貯飼料的NDF含量無顯著影響；濾袋與淀粉酶之間對青貯飼料NDF含量的測定無顯著的交互作用(P<0.05)。

表1 洗滌劑對濾器質量的影響

2.3不同濾器對青貯飼料NDF含量的影響 在中性洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶后，不同青貯飼料經過3種濾器測得的NDF結果差異情況不同，但是，與其他2種濾袋相比，通過P2型玻璃坩堝進行熱抽濾所測得的結果均存在增高的趨勢，尤其以TMR青貯飼料表現最為顯著(P<0.05)；其他7種青貯飼料經3種濾器測得的結果相差不顯著；8種青貯飼料經過ANKOM濾袋和CAU濾袋所得NDF值均無顯著差異(表2)。

2.4連續洗滌法對青貯飼料ADF測定結果的影響 與范氏洗滌法相比，連續洗滌法對ADF測定結果的影響因青貯種類不同而存在差異。除P2型玻璃坩堝測定全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料的ADF外，經過連續洗滌法測定的ADF均存在減小的趨勢，與對照相比，苜蓿青貯飼料和尖葉胡枝子青貯飼料的ADF含量變化較為顯著(P<0.05)(表3)。連續洗滌法在測定全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料ADF時，實驗未能完全消除P2型玻璃坩堝對NDF測定結果的影響，導致P2型玻璃坩堝測定的ADF結果顯著高于對照(P<0.05)，其他種類青貯飼料的ADF無顯著變化。在使用連續洗滌法測定ADF時，此法與濾器無顯著交互作用(P>0.05)，連續洗滌法與青貯種類以及青貯種類與濾器均存在顯著交互作用(P<0.05)。

表2 酶處理對不同濾器中青貯飼料NDF含量的影響

表3 連續洗滌法對青貯飼料ADF含量的影響

2.5不同濾器對青貯飼料ADF的影響 使用3種不同濾器測定不同青貯飼料NDF后，繼續進行酸性洗滌處理。由于測定NDF時各種濾器孔徑存在不同的阻塞，全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料經P2玻璃坩堝進行熱抽濾后所測得的ADF值顯著(P<0.05)高于其他2種濾器的測定結果，其他種類青貯飼料經3種濾器所測結果均無顯著差異(表3)。

3 討論

3.1酶處理對青貯飼料NDF的影響 本研究表明，測定不同青貯飼料NDF含量時，在中性洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶，只對全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料產生顯著影響，這主要由于全株玉米青貯飼料和TMR青貯飼料中高淀粉含量的玉米籽實所致。也有研究指出[11]，測定高淀粉含量玉米樣品的NDF時，必須在洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶。NDF是對植物細胞壁或纖維成分的一種測量指標，所測得的NDF主要由不溶性的非淀粉多糖和木質素組成。在測定高淀粉青貯飼料的NDF時，有效地去除其中的淀粉，是保證實驗結果準確性的必需步驟，只有在中性洗滌劑中添加耐高溫α-淀粉酶才會顯著地提高測定結果的準確性，而對于淀粉含量低的青貯飼料，添加耐高溫α-淀粉酶則會增加測定成本[22]。隋連敏等[11]在測定玉米樣品的NDF時，研究了酶量的確定，指出在分析高淀粉含量樣品的NDF時，耐高溫α-淀粉酶的適宜用量為每濾袋0.8～1.0 mL。本研究中使用的酶量與其相符，試驗結果也說明青貯樣中的淀粉得到了充分的水解，實驗的準確性得到了提高。

3.2連續洗滌法對青貯飼料ADF的影響 本研究表明，與傳統的范氏洗滌法相比，苜蓿青貯飼料和尖葉胡枝子青貯飼料經過連續洗滌法所測ADF含量顯著減小；連續洗滌法測定全株玉米青貯飼料與TMR青貯飼料的ADF含量顯著高于范氏洗滌法測定結果，這主要由于玻璃坩堝在測定這2種青貯飼料NDF時，高淀粉導致砂芯被堵，以致過濾困難，最終導致ADF結果偏高。薛紅楓和孟慶翔[12]采用連續洗滌法對玉米青貯飼料ADF進行測定，但是未與傳統的范氏洗滌法進行比較，很多學者對粗飼料中的ADF也做了大量研究[23-24]，但是采用的均是傳統的洗滌法，所以連續洗滌法測定青貯飼料ADF含量的可行性還有待進一步的研究。

3.3濾器對青貯飼料NDF和ADF測定結果的影響 中性洗滌劑和酸性洗滌劑對各種濾器的質量影響不明顯，因此在使用這幾種濾器時，可以忽略濾器對測定結果的影響，這與魏時來等[16]的研究結果相同。ANKOM濾袋和CAU濾袋是由特殊材料所制成，可耐受強烈化學試劑，合理的孔徑可以保證洗滌液的自由流通，從而濾器質量不受洗滌劑的影響[5,19]。本研究表明，3種濾器測得的青貯飼料NDF和ADF值無顯著差異，但是使用P2型玻璃坩堝所測得的值卻存在情況不同的增大趨勢，尤其是在淀粉含量高的全株玉米青貯和TMR青貯飼料上體現最為明顯，這主要是由于樣品中含有大量的淀粉，玻璃砂鍋孔徑被堵所致。正如馮繼華等[25]所述，由于待測樣品中含有較多的樹脂、蛋白質、多糖等物質，在抽濾分離的過程中這些細小的顆粒容易在玻璃砂芯濾板表面形成致密層，或者直接堵住濾板細孔，阻礙過濾過程，明顯延長過濾時間，甚至難以過濾，導致測定失敗。薛紅楓和孟慶翔[12]比較了這3種濾器對飼料樣品NDF和ADF測定結果的影響，發現ANKOM濾袋和CAU濾袋對飼料樣品中NDF和ADF的測定結果的相似系數(R2)均為0.996，玻璃坩堝與其他2種濾袋的相似系數也很高，這主要是由于試驗中所使用的玻璃坩堝型號以及試驗樣品與本研究不同，關于P2型玻璃坩堝在測定青貯飼料中NDF和ADF試驗的可行性，仍需大量試驗驗證。

4 結論

ANKOM濾袋和CAU濾袋適用于內蒙古地區常見青貯飼料NDF和ADF含量的測定，對于淀粉含量高的青貯飼料，需要在測定過程中進行酶處理以提高測定的準確性，在使用玻璃坩堝測定高淀粉含量的青貯飼料時應謹慎對待。連續洗滌法對苜蓿青貯飼料和尖葉胡枝子青貯飼料的影響較為顯著，對其他種類青貯飼料的ADF含量無顯著的影響，其原因仍有待進一步研究探討。

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