百合屬‘普瑞頭’的組織培養和快速繁殖

張彥妮，李文英

(東北林業大學園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

百合為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)，有很高的觀賞性,是高檔切花之一[1]。百合‘普瑞頭’(L.asitichybridscv. Prato)為亞洲雜種系百合[2]，株高平均約為83.3 cm，花朵直徑平均約為15.6 cm，碗型，橘紅色，無香味，抗寒性高，能在東北地區露地越冬[3]。由于抗寒性強，‘普瑞頭’是培育抗寒百合新品種的重要雜交親本，所以，對其的研究主要集中在花粉生活力的測定、遠緣雜交以及百合遠緣雜交的胚囊和胚胎發育及胚拯救等方面[4-8]。目前，對百合的組織培養和擴繁也有研究，但相對較少[9-10]。本研究以亞洲百合品種‘普瑞頭’鱗莖為材料，設置不同激素種類和濃度，以期完善‘普瑞頭’鱗片組織培養再生體系，為其生產擴繁、脫毒復壯、基因轉化等工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 亞洲百合品種‘普瑞頭’的鱗莖取自東北林業大學園林學院花卉研究所。

1.2方法

1.2.1無菌材料的獲得 洗去‘普瑞頭’鱗莖表面的泥土，除去有病斑和機械損傷的鱗片，取中外層無病斑的鱗片，放入三角瓶中，加入適量洗衣粉，然后放在自來水下沖洗3～4 h，在超凈工作臺上用無菌水沖洗3次，再用75%酒精消毒20～30 s后用無菌水沖洗3遍，放入0.1%升汞溶液中，滴入2～3滴吐溫消毒8 min，期間不斷搖晃，再用無菌水沖洗5～6次。用無菌濾紙吸干鱗片表面的水分。把鱗片切成0.5 cm×0.5 cm左右的小塊接種在MS培養基附加不同濃度6-BA(0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50 mg·L-1)和NAA(0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50 mg·L-1)的培養基中。采用鱗片內側向上平放的接種方式，每個處理3個重復，定期統計不定芽的分化情況。

1.2.2再生小鱗莖鱗片誘導 待再生小植株上的小鱗莖直徑超過0.5 cm時，取中外層，接種在MS培養基附加不同濃度6-BA(0、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mg·L-1)和NAA(0、0.05、0.50、1.00、1.50 mg·L-1)的培養基中，每個處理3個重復，一個月后觀察記錄誘導分化結果。

1.2.3生根壯苗 待組培苗約2 cm高時，切取長勢好、無根的苗，接種到生根培養基(MS+0.05 mg·L-1IBA、MS+1.00 mg·L-1IBA、MS、1/2 MS+0.05 mg·L-1IBA、1/2 MS+0.50 mg·L-1IBA、1/2 MS+1.00 mg·L-1IBA、1/2 MS+2.00 mg·L-1IBA、1/2 MS)上，一個月后統計生根率、平均生根數。

1.2.4煉苗移栽 將生根后的組培苗進行煉苗移栽，先打開三角瓶口的封口膜，經過1 d后，取出并洗凈根部附著的培養基，移栽到蛭石中，15 d后移栽到沙和土壤混合壤土中，30 d后統計成活率。

1.3培養條件 所有培養基都采用固體MS培養基,培養基中蔗糖30 g·L-1、瓊脂8 g·L-1，pH值為5.8～6.0。1/2 MS培養基中，大量元素減半，pH值不變。培養溫度為(25±2) ℃，日光燈光源，光照強度2 000～3 000 lx，光照時間10～12 h·d-1。

1.4數據分析 不同激素、培養基對組培效果影響用Statistica 7.0中的多因素方差(Factorial ANOVA)分析進行。

2 結果與分析

2.1‘普瑞頭’鱗片在不同激素組合培養基上的分化效果 將鱗片消毒后接入到培養基上，結果發現，剛接入的外植體為乳白色，15 d左右基部略有膨大，20 d 左右開始出現淡黃綠色愈傷組織，主要集中在鱗片外側靠近培養基處。鱗片的下部容易形成愈傷，上部和中部大多沒有明顯的愈傷組織生成。外植體多直接形成小鱗莖狀突起，然后分化成不定芽(圖1)。結果表明(表1)，培養基中只加NAA時，在濃度為0.05 mg·L-1時分化率最高(55.56%)。培養基中只加6-BA，濃度為1.5 mg·L-1時分化率最高(66.67%)，但平均分化芽數少于濃度為1.0 mg·L-1時的分化率。當6-BA濃度為1.5 mg·L-1時，不定芽呈叢狀生長，生長較弱，有畸形芽出現。同時添加6-BA和NAA，能明顯促進不定芽的生成，誘導率高于單獨添加6-BA和NAA。在培養基MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA上分化率最高(85.00%)，且平均每塊分化的芽數最多(3.60個)。所以，誘導小鱗莖的最適宜培養基為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。方差分析結果(表2)表明，不同濃度6-BA和NAA組合對外植體分化率和平均芽個數影響顯著。

2.2不同激素濃度對再生小鱗莖鱗片分化的影響 再生小鱗莖鱗片的再生能力較強，20 d左右即可分化出小苗，誘導率均達到100%。結果表明(表3)，單獨添加6-BA時，濃度在1.0 mg·L-1時不定芽分化數最多(4.67個)，植株長勢良好(圖2)；單獨添加NAA時,隨著NAA的濃度增大，平均生成的根數增多，但是誘導的芽數減少且出現畸形根，NAA的濃度為0.5 mg·L-1時平均生成的芽數最多(3.58個)，且小苗生長健壯；同時添加6-BA和NAA時，6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，誘導的苗長勢不佳，黃色且畸形，6-BA濃度為0.5 mg·L-1、NAA的濃度為0.05～0.50 mg·L-1時，誘導率和產生的芽數都很高，隨著NAA濃度增大生成的根數增多，但當NAA的濃度達到1.00 mg·L-1時生成的芽數較少且誘導的苗長勢不佳，根出現畸形；既能獲得數量很多的不定芽又能直接用于生根移栽的最適培養基為MS+0.5 mg·L-1NAA，誘導不定芽的最適培養基為MS+1.0 mg·L-16-BA。方差分析結果(表4)表明，6-BA和NAA濃度對再生小鱗莖鱗片的芽個數、生根率、生根系數影響顯著。

圖1 鱗片上誘導出的愈傷組織和叢生芽Fig.1 Callus and adventitious buds induced from bulbscale

表1 不同濃度6-BA和NAA組合對‘普瑞頭’鱗片分化能力的影響

表2 6-BA和NAA濃度對‘普瑞頭’鱗片分化能力影響的方差分析結果

圖2 生長良好的叢生芽Fig.2 Cluster-shoots growing well

2.3生根培養 當叢生芽長為2 cm左右時，把叢生芽分成單株，接種到生根培養基中誘導生根，7 d后接種到含有IBA的培養基上的多數單株都有根生成，30 d后，觀察記錄根的生長狀況。結果表明(表5)，1/2 MS培養基對于生根的影響好于MS培養基。IBA能促進生根，隨著IBA濃度升高，生根率及平均根數都明顯增加。但IBA濃度達到0.5 mg·L-1時苗的葉尖就出現白化現象，濃度超過1.0mg·L-1時，葉尖白化且苗的生長狀況不佳，萎蔫且根畸形。所以，最適的生根培養基為1/2 MS + 0.5 mg·L-1IBA(圖3)。方差分析結果(表6)表明，基本培養基、IBA濃度對生根率和生根系數影響顯著。

表3 不同激素濃度對再生小鱗莖鱗片分化的影響

表4 6-BA和NAA濃度對再生小鱗莖鱗片分化影響的方差分析結果

表5 基本培養基和IBA濃度對叢生芽生根的影響

圖3 叢生芽的生根

2.4組培苗的馴化及移栽 打開三角瓶的封口，1 d后小心取出生根的無菌苗，洗凈其根部的培養基，移栽到蛭石中，遮陰處理，注意通風保濕，15 d后把無菌苗從蛭石中取出放入壤土(壤土和沙的比例為2∶1)中，無菌苗的成活率超過85.0%，且移栽后生長狀況良好(圖4)。

圖4 移栽成活的苗Fig.4 Survival seedlings after transplanting

3 討論與結論

百合不同部位的鱗片不定芽的分化能力不同，外層、中部鱗片的分化能力大于內部鱗片[11-12]，所以本研究直接采用外中層鱗片作為外植體進行不定芽誘導。外源生長素和細胞分裂素是細胞離體培養所必需的激素，合適的濃度和種類的適宜配比不但可以誘導細胞分裂和生長，而且能控制細胞分化和形態建成[13]。不同激素組合對百合鱗片誘導分化不定芽的能力存在差異[14]，培養基中只加6-BA，濃度為1.0 mg·L-1時的分化率高且平均分化芽數最多。這與周蘊薇等[10]的研究結果相同，但是分化率及分化系數低于其結果，這可能是因為升汞比次氯酸鈉對鱗片的毒害作用大。培養基中6-BA與NAA的適宜搭配，可使芽的誘導和增殖達到最高比率。但是6-BA與NAA的比例不能過高，否則會導致誘導率極低[15]。6-BA質量濃度過高會使部分鱗片產生不定根，抑制不定芽的生成，植株細弱，不利于再生植株的正常發育[16-17]。本研究中當NAA和6-BA的濃度超過1.5 mg·L-1時不定芽的誘導率比較低且出現畸形芽，證實了這一理論。

表6 培養基和IBA濃度對叢生芽生根影響的方差分析結果

再生小鱗莖鱗片的誘導效果及誘導周期短，分化能力強，可以作為百合組培再生體系較好的外植體，愈傷的誘導率較高且愈傷的質量較好。誘導無菌小鱗莖鱗片生成不定芽數量多且生長健壯的培養基為MS+1.0 mg·L-16-BA。而在MS附加NAA 0.5 mg·L-1的培養基上誘導出的不定芽及生根多，且植株生長健壯，可直接用于生根移栽，且大大縮短了育苗周期。1/2 MS培養基比MS培養基的生根效果好，這和前人的研究結果相一致[18-19]，可能是由于MS培養基含有較高濃度的無機鹽而抑制了不定根的形成。IBA對生根有促進作用，但IBA過高，根的數量過多，抑制根的伸長，容易發生老化現象。崔剛等[20]對櫻桃(Cerasuspseudocerasus)、蘋果(Maluspumila)等進行瓶外生根，未生根的苗木得到了充分的利用，所以也可以嘗試用瓶外生根的方式縮短百合育苗周期。

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