外植體及氮源對甘草愈傷組織誘導(dǎo)的影響

枊福智，藺海明，李占強(qiáng)，張漢平

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.酒泉甘草生物育種研究所，甘肅 酒泉 735000)

甘草(Glycurrihizauralensis)是豆科甘草屬多年生草本植物，以根和根莖入藥[1],具補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳和調(diào)和諸藥等功效，是我國2 000多種草藥中用量最大的傳統(tǒng)中藥材之一。甘草不僅用于醫(yī)藥方面，而且在食品、日用化學(xué)品、煙草等行業(yè)也被廣泛應(yīng)用[2]。甘草根系發(fā)達(dá)，生命力強(qiáng)，是半干旱荒漠地區(qū)優(yōu)良的藥用和防風(fēng)固沙植物[3];具有抗寒、耐旱、抗鹽堿、固沙和改良土壤等作用，對防止水土流失和改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。甘草廣泛分布于我國西北干旱的溫帶荒漠和溫帶草原區(qū)域[4]。近年來，隨著國內(nèi)和國際市場需求的不斷增加，野生資源被過度采挖，致使甘草質(zhì)量和產(chǎn)量下降，種質(zhì)資源遭到嚴(yán)重破壞[5]。甘草從播種到成功結(jié)實(shí)周期較長，至少需要4～5年，種子繁育緩慢已成為制約甘草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[6]。為解決這一矛盾，很多研究者采用基因工程和組織培養(yǎng)技術(shù)開展工作，為野生甘草資源的保護(hù)和新品種選育提供了新途徑。對于甘草種苗和組培技術(shù)研究，Zheng等[7]研究了鎘對甘草種苗生長和抗氧化劑的影響；劉昕等[8]對脹果甘草(G.inflata)愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率進(jìn)行了研究；陳巍等[9]對下胚軸、根尖和根中部進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)的研究。營養(yǎng)元素在愈傷組織的生長過程中起著很重要的作用，但有關(guān)不同外植體和不同濃度的氮源對甘草愈傷組織生長的影響研究相對較少。本研究以甘草無菌苗的不同外植體為材料，研究不同外植體及氮源對甘草愈傷組織誘導(dǎo)率及生長狀況的影響，旨在選擇誘導(dǎo)甘草愈傷組織的最佳外植體和氮源濃度，為甘草優(yōu)質(zhì)苗的工廠化快速繁殖提供理論及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 以烏拉爾甘草無菌苗的下胚軸、莖、子葉、胚根為試驗(yàn)材料。

1.2方法

1.2.1無菌苗的獲得 選取優(yōu)質(zhì)的烏拉爾甘草種子，用自來水充分清洗，然后用75%乙醇滅菌30 s，無菌水沖洗3次，0.1%氯化汞常規(guī)滅菌10～15 min，無菌水沖洗3次，然后用滅菌濾紙吸干種子表面的水分，將種子接到MS培養(yǎng)基上，pH值5.8，培養(yǎng)室溫度28 ℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，每天光照時(shí)間為12～14 h，培養(yǎng)室濕度為70%左右，培養(yǎng)25 d左右可得甘草無菌苗。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo) 采用培養(yǎng)出的烏拉爾甘草無菌苗的胚根、莖、子葉、下胚軸為外植體材料，接種于前期優(yōu)選的最佳激素組合MS+6-BA 0.6 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1上[6]，瓊脂5 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，培養(yǎng)基的pH值5.8。每個(gè)處理20瓶，于高溫、高壓下滅菌30 min，恒溫放置12 h后接種。等愈傷組織誘導(dǎo)出后，每隔5 d測定一次愈傷組織的鮮質(zhì)量，觀察和記錄外植體形成不同顏色的愈傷組織數(shù)目，并計(jì)算每種顏色愈傷組織所占的比例。

1.2.3氮源濃度對甘草愈傷組織誘導(dǎo)影響的測定 以甘草無菌苗下胚軸為外植體，接種于含不同氮源濃度的MS+6-BA 0.6 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1培養(yǎng)基上，氮源為KNO3和NH4NO3的總濃度(KNO3∶NH4NO3=1∶1)，設(shè)6個(gè)處理，濃度分別為0、60、120、180、240、300 mmol·L-1。每個(gè)處理做20瓶，重復(fù)3次。每2 d觀察一次，記錄下胚軸出愈個(gè)數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)率。

1.2.4愈傷組織誘導(dǎo)率的計(jì)算方法

1.3統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1不同外植體對出愈率的影響 在相同的培養(yǎng)條件下，外植體不同，誘導(dǎo)率也不同，且差別較大(圖1)。在接種數(shù)相同的情況下，愈傷組織誘導(dǎo)率的差異較為明顯，其中下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，莖的愈傷組織率最低。經(jīng)方差分析，不同外植體誘導(dǎo)率均差異顯著(P<0.05)，由試驗(yàn)結(jié)果可知，4種外植體愈傷組織誘導(dǎo)率以下胚軸最高(93.9%)，之后依次是子葉(79.5%)、胚根(73.9%)、莖(65.5%)。

2.2不同外植體對愈傷組織顏色的影響 4種不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中淡黃色占的比例較高(表1)，其中胚根為44.4%，莖為33.5%，子葉為56.2%，下胚軸為68.4%。4種不同外植體中，莖誘導(dǎo)出的愈傷組織的褐化率最高，為20.0%，下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織的褐化率最低，為5.6%。

圖1 不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

4種不同外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織中，呈現(xiàn)黃綠色和乳白色最多的分別為莖和胚根，分別為33.4%和27.8%。經(jīng)方差分析，胚根和下胚軸各顏色愈傷組織占愈傷組織總數(shù)的比例差異顯著(P<0.05)。從愈傷組織生長狀況來看，莖和胚根誘導(dǎo)出的愈傷組織松散，而且生長緩慢，較易褐化；子葉不易誘導(dǎo)愈傷組織，而且生長緩慢，質(zhì)地較差；下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織生長快，愈傷組織呈現(xiàn)顆粒狀，質(zhì)地軟硬適宜，誘導(dǎo)率高，生長好。因此，下胚軸是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。

表1 不同顏色愈傷組織占愈傷組織總數(shù)的比例

2.3不同外植體對愈傷組織生長狀況的影響 甘草愈傷組織生長呈“S”形變化，愈傷組織生長的前10 d，其生長比較緩慢；10～25 d，愈傷組織生長迅速，其鮮質(zhì)量增加較快；25 d以后愈傷組織生長趨于緩和(圖2)。下胚軸的愈傷組織生長較快，其鮮質(zhì)量的生長量均大于莖、子葉和胚根的愈傷組織生長量。子葉形成的愈傷組織生長比較緩慢，25 d以后愈傷組織生長迅速，比莖和胚根形成的愈傷組織生長快；愈傷組織鮮質(zhì)量明顯高于莖和胚根的愈傷組織生長量。莖的愈傷組織從誘導(dǎo)形成到生長至25 d，其生長速度僅次于下胚軸，愈傷組織鮮質(zhì)量生長量比子葉和胚根的要快，25 d以后愈傷組織生長趨于緩慢。從愈傷組織生長積累的變化可以看出，外植體對愈傷組織的誘導(dǎo)和生長狀況有重要的影響，外植體不同，愈傷組織誘導(dǎo)的難易和生長快慢各不相同。綜合愈傷組織的生長狀況，下胚軸是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。

圖2 甘草愈傷組織鮮質(zhì)量變化曲線

在愈傷組織誘導(dǎo)的前10 d，不同外植體愈傷組織的平均日生長速率比較緩慢(表2)，其中下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織平均日生長速率最高，為7.66 mg·d-1；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，愈傷組織的平均生長速率逐漸增加，生長至15～20 d時(shí)，除子葉外，不同外植體的平均日生長速率達(dá)到最大，其中下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織平均日生長速率最高，為19.06 mg·d-1；子葉誘導(dǎo)出的愈傷組織平均日生長速率在20～25 d時(shí)最高，為19.46 mg·d-1；子葉形成愈傷組織平均日生長速率比較緩慢。經(jīng)方差分析，不同外植體之間愈傷組織的平均日生長率差異顯著 (P<0.05)。20 d以后除子葉外，其他外植體的愈傷組織平均生長速率明顯下降。分析表明，下胚軸從誘導(dǎo)愈傷組織開始到20 d時(shí)平均日生長率明顯高于其他外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織，所以下胚軸具有較高的生長速率，是最佳的外植體。

2.4不同濃度的氮源對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 不同濃度的氮源對甘草下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響結(jié)果顯示(圖3)，氮源濃度對甘草下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)有明顯的影響。低濃度和高濃度的氮源均不利于愈傷組織的誘導(dǎo)，在氮源濃度為60 mmol·L-1時(shí)，從試驗(yàn)得知，培養(yǎng)9 d后，下胚軸周圍形成了大量的黃綠色的愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到了92.5%，隨著氮源濃度的升高愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸下降，且生長速度減慢。在氮源濃度為300 mmol·L-1時(shí)，幾乎沒有愈傷組織產(chǎn)生，誘導(dǎo)率最低，為10.2%。這表明，最佳的氮源濃度是愈傷組織誘導(dǎo)成功與否的關(guān)鍵因素，經(jīng)方差分析，不同氮源濃度對下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率的影響均達(dá)到顯著差異(P<0.05)。

2.5不同濃度的氮源對愈傷組織生長量積累的影響 愈傷組織鮮質(zhì)量呈“S”型變化(圖4)。甘草下胚軸在接種5 d時(shí)鮮質(zhì)量有所增加，是由于其接種到新鮮培養(yǎng)基上吸水膨脹的結(jié)果，接種10～20 d甘草愈傷組織鮮質(zhì)量增加最快，25 d以后愈傷組織鮮質(zhì)量的增加都趨于緩慢。氮源濃度為60mmol·L-1時(shí)，愈傷組織鮮質(zhì)量積累最快，達(dá)到9.15 mg·d-1；氮源濃度為300 mmol·L-1時(shí)，愈傷組織鮮質(zhì)量最小，為6.25 mg·d-1。由此可見，氮源濃度對愈傷組織的生長量有明顯的影響，因此，適宜于甘草下胚軸愈傷組織生長的最佳氮源濃度為60 mmol·L-1。

表2 不同外植體愈傷組織的階段生長速率

圖3 氮源濃度對對下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

圖4 氮源濃度對愈傷組織生長量的影響

3 討論與結(jié)論

外植體是影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素之一。各種外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織的難易及其所需求的條件有很大的不同，這與外植體供體的遺傳因素、基因型和外植體本身的生理生化狀態(tài)密切相關(guān)。同一種植物不同的組織和器官再生能力也有很大差異，本試驗(yàn)中，甘草的外植體不同，對愈傷組織的誘導(dǎo)和生長的影響不同，下胚軸是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體，愈傷組織生長好且誘導(dǎo)率最高，子葉較不容易誘導(dǎo)愈傷組織，而且生長比較緩慢且質(zhì)地較差；莖和胚根誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地松散，生長較慢且易褐化；甘草不同外植體愈傷組織的生長呈“S”型變化，愈傷組織在不同的生長階段快慢程度不一。

本試驗(yàn)以甘草下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷組織具有較高的誘導(dǎo)率和較好的生長狀況，是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。該結(jié)論與范小峰等[10]以甘草的子葉、下胚軸及胚根為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)所得結(jié)論基本一致。根據(jù)細(xì)胞全能性理論，植物任何器官都可以用作外植體，但不同組織器官培養(yǎng)成功的難易程度是不同的[11]。在甘草不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的過程中可以得出，外植體不同，對愈傷組織誘導(dǎo)的影響效應(yīng)不同。因此，如何選擇最佳外植體是愈傷組織能否高效誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素之一。

營養(yǎng)元素在細(xì)胞培養(yǎng)中具有非常重要的作用。在離體條件下，植物細(xì)胞需要從培養(yǎng)基中攝取必需的營養(yǎng)元素才能維持細(xì)胞正常的生理生化等一系列代謝過程，當(dāng)這些營養(yǎng)元素以適當(dāng)?shù)臐舛却嬖跁r(shí)才有利于細(xì)胞的生長和次生代謝物的積累。氮是細(xì)胞中核酸的組成成分，也是生物體許多酶的成分。氮被植物吸收利用后轉(zhuǎn)化為氨基酸，再轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)，然后被植物利用。氮源的種類和濃度對細(xì)胞生長和次生產(chǎn)物合成的影響非常顯著[12]。本試驗(yàn)中，研究了不同濃度的氮源對甘草無菌苗的下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響，由結(jié)果可以看出，較低和較高濃度的氮源都不利于愈傷組織的生長，適宜甘草下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)和生長的最佳氮源濃度為60 mmol·L-1。愈傷組織誘導(dǎo)和生長過程中受多種綜合因素的影響，因此，各種復(fù)雜因素對愈傷組織生長和干物質(zhì)積累有待于更加深入的研究。

[1] 肖培根.新編中藥志(第一卷)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002：259-277.

[2] 王巧餓，任紅，曹雪麗.甘草研究開發(fā)與利用現(xiàn)狀[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27(4)：290-295.

[3] 藺海明，紀(jì)英，邱黛玉.灌水對沙漠綠洲區(qū)甘草生長動態(tài)和產(chǎn)量的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2011，28(11)：1992-1997.

[4] 周應(yīng)群，陳士林，趙潤懷.藥用甘草植物資源生態(tài)學(xué)研究[J].中草藥，2009，40(10)：1668.

[5] 魏勝利，王全文，王海.我國中西部地區(qū)甘草資源及其可持續(xù)利用的研究[J].中國中藥雜志，2003，28(3)：202.

[6] 趙晶，柳福智，藺海明.不同外植體對甘草愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38(19)：36-38.

[7] Zheng G,Lv H P,Gao S,etal.Effects of cadmium on growth and antioxidant responsesinGlycyrrhizauralensisseedlings[J].Plant Soil Environment,2010,56(11):508-515.

[8] 劉昕，王清，于斌.不同外源激素對脹果甘草愈傷組織誘導(dǎo)及褐化的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(6):88-93.

[9] 陳巍，于泉林，高文遠(yuǎn)，等.甘草愈傷組織培養(yǎng)的研究[J].中國中藥雜志，2005，30(9)：713-715.

[10] 范小峰，楊穎麗，郭小強(qiáng)，等.烏拉爾甘草不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及影響因子研究[J].中藥材，2009，32(2)：173-176.

[11] 曹君邁，李強(qiáng)，王崇.烏拉爾甘草胚狀體的誘導(dǎo)及再生體系的建立[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，24(3)：522-526.

[12] Kim S H,Kim S K.Effect of nitrogen source on cell growth and anthocyanin production in callus and cell suspension culture of ‘Sheridan’ grapes[J].Journal of Plant Biotechnology,2002,4(2):83.