外源激素對紫穗狼尾草愈傷組織誘導及分化的影響

張曉瑩，張瀚儷，牟 彤，龔束芳

(1.東北農業大學園藝學院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.國家廣電總局2024臺，黑龍江 佳木斯 154007)

由于獨特的形態和生態特點，觀賞草在豐富園林植物景觀中的作用越來越受到人們的重視[1-3]。紫穗狼尾草(Pennisetumalopecuroides)花序獨特、株型柔美、生性強健、適應性強，具有極高的觀賞價值和經濟價值，應用前景廣闊[4-5]。哈爾濱地區園林植物景觀中類似于紫穗狼尾草這種抗逆性強、低養護成本的植物資源匱乏，引種栽培紫穗狼尾草可以豐富該地區園林植物資源、創造獨特的園林植物景觀。引種結果表明[5]，紫穗狼尾草能夠露地越冬，為確保其快速繁殖及推廣應用，進而對紫穗狼尾草的植株再生進行相關研究，明確外源激素對其植株再生的影響是十分必要的。本試驗對紫穗狼尾草愈傷組織誘導及分化的激素種類及濃度配比進行篩選，旨為建立紫穗狼尾草的植株再生體系提供依據，也為今后導入抗寒等目的基因、體細胞無性系變異的篩選等抗性育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料 紫穗狼尾草由東北農業大學園林系實驗中心提供，于2008年4月從“北京草業與環境研究發展中心”引種栽培。

1.2試驗方法

1.2.1無菌外植體培養 選取成熟飽滿的紫穗狼尾草種子，剝去種子外包片，蒸餾水洗凈。在超凈工作臺中用75%的酒精浸泡40 s，無菌水沖洗3～4次，再用3%次氯酸鈉對外植體分別消毒5.0 min，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干后接種于MS培養基。培養一周后，選擇無污染的種子為試驗材料，待無菌種子萌發后，以帶種子的幼芽為外植體，進行愈傷組織誘導。

1.2.2愈傷組織的誘導 2,4-D對狼尾草愈傷組織誘導的影響：將外植體接種于愈傷組織誘導培養基中。以MS為基本培養基，添加不同質量濃度的生長素2,4-D(0，1.0，2.0，3.0,4.0,5.0，6.0 mg·L-1)，每個處理接種50個外植體，進行暗培養。每7 d觀察一次，15 d繼代培養一次，第30天統計出愈個數，并計算愈傷組織誘導率。

2,4-D、NAA、KT激素組合對愈傷組織誘導的影響：將外植體接種于愈傷組織誘導培養基上。以MS為基本培養基，添加不同濃度的激素2,4-D、NAA、KT(表1)，采用3因素3水平的L9(34)正交設計。每個處理接種50個外植體，進行暗培養。每7 d觀察一次，15 d繼代培養一次，第30天統計出愈個數，并計算愈傷組織誘導率。

表1 2,4-D、NAA、KT因素水平

2,4-D、KT、6-BA激素組合對愈傷組織誘導的影響：將外植體接種于愈傷組織誘導培養基上。以MS為基本培養基，添加不同質量濃度的植物生長調節劑2,4-D、KT、6-BA(表2)，采用3因素3水平的L9(34)正交設計。每個處理接種50個，進行暗培養。每7 d觀察一次，第30天統計出愈個數，并計算愈傷組織誘導率。

表2 2,4-D、KT、6-BA因素水平

1.2.3愈傷組織的分化 選用長勢良好的狼尾草愈傷組織為試驗材料進行愈傷組織的分化研究。根據控制根或芽分化的激素模式——生長素/細胞分裂素模型，以MS為基本培養基，添加不同濃度的NAA、6-BA、KT(表3)，采用3因素3水平的L9(34)正交設計。每個處理各接種30個愈傷組織，置于光照條件下進行培養，溫度為(25±1) ℃。每7 d觀察一次，每15 d繼代培養一次，第30天統計結果。

1.2.4數據統計與分析

表3 NAA、6-BA、KT因素水平

采用Excel軟件對原始數據進行整理，采用極差分析法和方差分析法對愈傷組織誘導率和愈傷組織分化率等數據進行分析，k、R參數分別表示均值和極差[7]。

2 結果與分析

2.1植物生長調節劑對狼尾草愈傷組織誘導的影響 將外植體接種到各誘導培養基中(圖1-Ⅰ)，7 d左右周圍出現少量白色半透明的愈傷組織(圖1-Ⅱ)，15 d左右愈傷組織膨大(圖1-Ⅲ)，生長較快。為保證愈傷組織旺盛的生活力，誘導出的愈傷組織每15 d繼代一次，第30天統計愈傷組織數并計算誘導率。

2.1.1不同濃度2,4-D對狼尾草愈傷組織誘導的影響 未添加2,4-D的MS培養基(B1)中，幼芽周圍沒有愈傷組織形成，均干枯死亡(表4)。添加2,4-D的MS培養基，均可誘導出愈傷組織，說明2,4-D對愈傷組織的形成具有促進作用。但是不同濃度的2,4-D對愈傷組織的誘導能力存在明顯差異。2,4-D質量濃度為1.0～3.0 mg·L-1時誘導率逐漸提高，為3.0～4.0 mg·L-1時誘導率逐漸下降。由此可見，在一定范圍內適當提高2,4-D的濃度有利于愈傷組織的誘導，濃度過高則起到抑制作用。

2.1.2NAA、2,4-D和KT激素組合對狼尾草愈傷組織誘導的影響 愈傷組織誘導率效果最好的激素組合為C5培養基，誘導率為84%(表5)。而當激素配比為C9培養基時，愈傷組織誘導率最低，為24%。對正交試驗結果進行分析，各因素的極差由大至小順序為RA(46.667)>RB(8.667)>RC(8.000)，說明各因素對愈傷組織誘導率的作用大小為2,4-D>NAA>KT。NAA與KT的作用相近，且均以較低濃。度為宜，其濃度保持在0.5～1.0 mg·L-1對于因素A，k2(78.667)>k1(53.333)>k3(32.000)，說明不同質量濃度的2,4-D對狼尾草愈傷組織誘導的能力由強到弱的順序為3.0>1.0>5.0 mg·L-1。對于因素B，k2(60.000)>k3(52.667)>k1(51.333)，說明不同濃度的NAA對狼尾草愈傷組織誘導的能力由強到弱的順序為1.0>2.0>0.5 mg·L-1。對于因素C，k3(59.333)>k2(53.333)>k1(51.333)，說明不同質量濃度KT對狼尾草愈傷組織誘導的能力由強到弱的順序為1.0>0.5>0.1 mg·L-1。

圖1 狼尾草誘導愈傷組織的過程

表4 不同質量濃度2,4-D對愈傷組織誘導的影響

比較各因素的k值，最大的k值分別是因素A的k2(78.667)，因素B的k2(60.000)，因素C的k3(59.333)，因此理論上9種誘導培養基中最佳試驗組合為MS+2,4-D 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1。該誘導培養基中外源激素的種類及濃度配比與C5培養基相同。

2.1.3KT、2,4-D和6-BA激素組合對愈傷組織誘導的影響 愈傷組織誘導率最高為74%，其激素組合為D6培養基，D7培養基時，愈傷組織誘導率最低，為24%(表6)。正交試驗結果表明，各因素的極差，由大至小順序為RA(33.333)>RB(14.000)>RC(2.667)，說明各因素對愈傷組織誘導率的作用大小為2,4-D>KT>6-BA。

綜上可知，2,4-D對紫穗狼尾草愈傷組織的誘導作用最強，NAA和KT的誘導作用相對較弱，6-BA的作用最弱。因此，最適合紫穗狼尾草愈傷組織誘導的培養基為MS+2,4-D 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1。

2.2植物生長調節劑對狼尾草愈傷組織分化的影響

2.2.1NAA與6-BA組合對狼尾草愈傷組織分化的影響 將紫穗狼尾草的愈傷組織轉接到各分化培養基，15 d后愈傷組織表面開始出現綠色芽點(圖2-Ⅰ)，30 d左右分化出不定芽(圖2-Ⅱ)。

不同質量濃度的NAA和6-BA配合使用時，狼尾草愈傷組織均出現不同程度的分化(表7)。愈傷組織分化培養基E7的分化率最高，為60%。培養基E3和E6的分化率均較低，且伴有褐化現象(圖2-Ⅲ)。

2.2.2NAA、6-BA、KT組合對狼尾草愈傷組織分化的影響 各激素組合的培養基中F3的分化率最高，為56.7%(表8)。分析各因素的極差，由大至小的順序為RA(15.567)>RB(12.233)>RC(4.433)，說明各因素對愈傷組織分化率的作用大小為NAA>6-BA>KT濃度。NAA對愈傷組織分化的作用較明顯，以0.5～1.0 mg·L-1與3.0 mg·L-16-BA配合效果最佳。

表5 愈傷組織誘導中 2,4-D、NAA、KT配組的正交試驗L9(34)結果

表6 愈傷組織誘導中2,4-D、KT、6-BA配組的正交試驗L9(34)結果

低濃度NAA和高濃度6-BA有利于愈傷組織的分化，分化率可達60%，NAA、6-BA和KT配合使用時，愈傷組織分化率最高達56.7%，可見KT對愈傷組織的分化無顯著影響。綜合以上研究，最適合紫穗狼尾草的愈傷組織分化培養基為MS+NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 3.0 mg·L-1。

圖2 狼尾草愈傷組織分化結果

表7 愈傷組織分化中NAA與6-BA組合的正交試驗L9(34)結果

3 討論與結論

狼尾草的離體培養及植株再生是切實可行的[8]，關于建立狼尾草再生體系的研究中，先后出現了以狼尾草幼穗[9]、莖節和頂芽[8]為外植體誘導愈傷組織，然后分化成植株的報道，但污染率高、誘導率及分化率低等問題普遍存在。本試驗采用成熟種子預先培養外植體的方法[10]，其操作簡單、成功率高。在此過程中植物生長調節物質在組織培養的過程中也擔任重要的角色。培養基中添加的外源激素組合及濃度直接影響體細胞愈傷組織的誘導及分化。

本研究采用正交設計和方差分析，通過對影響紫穗狼尾草外植體愈傷組織誘導及分化的外源激素進行分析，初步找出了主要影響愈傷誘導及分化的激素組合,使得紫穗狼尾草愈傷組織誘導率和分化率均有所提高。如在NAA、2,4-D和KT激素配比中愈傷組織誘導率最高可達84%，在NAA和6-BA激素配比中最高分化率可達60%，高于繆珊和范繼紅[11]的研究結果(44%)。在不同植物激素種類配比中，2,4-D對愈傷組織誘導具有決定性作用，在缺乏2,4-D的培養基中不能產生愈傷組織。生長素NAA和KT的作用相近，均以0.5～1.0 mg·L-1的濃度范圍對愈傷組織的誘導起促進作用，過低則作用不明顯，而過高又會抑制愈傷組織的形成。在愈傷組織分化中NAA的作用顯著，且以較低濃度(0.5～1.0 mg·L-1)與較高濃度(3.0 mg·L-1)6-BA配合使用時效果最佳，NAA達到2.0 mg·L-1時就會有褐化現象發生。KT對于愈傷組織分化的作用不明顯，從節約成本的角度可以少用甚至可以不用。

表8 愈傷組織分化中NAA、6-BA、KT配組的正交試驗L9(34)結果Tab.8 The results of L9(34)orthogonal test for NAA combined with 6-BA and KT on callus differentiation

本研究探討了不同外源激素對狼尾草愈傷組織誘導及分化的影響，優化了狼尾草植株再生體系，為利用分子育種等方法改良紫穗狼尾草的農藝學性狀奠定基礎。

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