短發(fā)卡RNA抑制人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達對人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖及凋亡的影響

張宏順，馬衍剛

(1開灤醫(yī)療集團錢家營醫(yī)院，河北唐山063301;2聊城市人民醫(yī)院)

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，膠質(zhì)瘤內(nèi)端粒酶的上調(diào)或重新激活是其無限增殖、生長、侵襲轉(zhuǎn)移所必需的，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的限速酶［1］。RNA干擾(RNAi)是生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，而短發(fā)卡 RNA (shRNA)可更明確、高效、穩(wěn)定地干擾目的基因的表達［2］。2010年6月～2011年7月，我們設計針對hTERT的 shRNA表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細胞U251，旨在探討RNAi治療膠質(zhì)瘤的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 pSilencer 1.0-U6載體(Line)，pSilencer 1.0-U6 GAPDH Control(Circular)，轉(zhuǎn)染試劑Siport xp-1購自美國Ambion公司，T4DNA連接酶限制性內(nèi)切酶(Promega公司)，膠質(zhì)瘤細胞株U251。

1.2 方法

1.2.1 尋找針對hTERT合適的靶序列 采用BLAST軟件對選擇的靶序列進行同源分析，排除抑制其他基因片段的可能。3'端加入終止信號TTTTTT，兩端分別加入ApaⅠ和IcorRⅠ的酶切位點，并加入LOOP環(huán)，克隆入pSilencer 1.0-U6質(zhì)粒U6啟動子的下游。hTERT靶基因(NM003219，nucleotides 745～765)序列為 5'-AAACGTGCCTTCAGCTAAGAA-3'。oligoA:5'-ACGTGCCTTCAGCTAAGAATTCAAGAGATTCTTAGCTGAAGGCACGTTTTTTT-3';oligoB:5'-AATTAAAAAAACGTGCCTTCAGCTAAGAATCTCTT-GAATTCTTAGCTGAAGGCACGTGGCC-3'。oligoA、B各取2 μL，退火、連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒。酶切電泳鑒定，測序鑒定，擴增，－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 質(zhì)粒DNA/Siport xp-1轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤細胞 脂質(zhì)體與DNA比例為3 μL∶1 μg，分為空白對照組、hTERT干擾組、陰性質(zhì)粒組，每孔細胞5× 105/L，分別于轉(zhuǎn)染后1、3、5、7 d收集細胞，檢驗目的基因的活性。

1.2.3 hTERT基因表達檢測 采用RT-PCR技術提取總RNA，使用兩步法、RT-PCR試劑盒操作，引物由Invitrogen公司合成。hTERT上游引物5'-TCTACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'，下游引物5'-GCTCCCACGACGTAGTCCATGTTCA-3';GAPDH上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳分離鑒定，凝膠成像儀顯像。

1.2.4 hTERT蛋白表達檢測 采用Western blotting技術收集細胞3×105/L，用磷酸鹽緩沖液、PBS洗滌3次后，提取蛋白，測OD值。配制標準蛋白濃度(50 μg/μL)加上樣緩沖液，100℃5 min變性;取樣品45 μL上樣于10%SDS-聚丙烯酰氨凝膠進行垂直電泳，濕轉(zhuǎn)63 min。NC膜依次放入封閉液、一抗、二抗，加入7 mL NBT/BCIP顯色劑，顯色1 h后轉(zhuǎn)移于雙蒸水中，掃描成像。

1.2.5 細胞的增殖及凋亡檢測 配PI-DNA熒光染色液，收集細胞5×105/L，PBS洗滌3次，4℃、75%乙醇固定過夜;加PI-DNA熒光染色液1 mL，4℃避光30 min，置流式細胞儀上檢測細胞的增殖周期及凋亡率。增殖指數(shù)(PI)=G2M+S/G0G1+S+ G2M。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，均數(shù)以s表示，組間比較采用單因素方差檢驗(ANOVA)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 酶切鑒定結(jié)果 酶切后，目的質(zhì)粒被切為3 000 bp和350 bp的兩條片段，測序結(jié)果顯示，插入序列與設計的shRNA堿基序列完全一致。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果 凝膠電泳圖顯示，在轉(zhuǎn)染后第3、5、7天hTERT PCR產(chǎn)物(202 bp)條帶明顯變細，亮度下降(與對照組比較)。利用ImageJ分析軟件分析證明，U251膠質(zhì)瘤中的hTERT基因呈高表達。shRNA對U251膠質(zhì)瘤hTERT基因表達有明顯抑制作用(P＜0.05)，在第3、5、7天抑制率分別為(77.00±14.23)%、(73.81±13.52)%、(71.52 ±15.87)%。

2.3 Western blotting檢測結(jié)果 顯色掃描成像后，第3、5、7天可見hTERT條帶變淡。ImageJ分析軟件分析證明，U251膠質(zhì)瘤中hTERT基因呈高表達。shRNA對U251膠質(zhì)瘤hTERT的表達有明顯抑制作用(P＜0.05)，在第3、5、7天抑制率分別為(71.51± 21.33)%，(72.00±17.69)%，(69.23±13.46)%。

2.4 膠質(zhì)瘤細胞增殖及凋亡情況 與對照組相比，hTERT干擾組細胞進入S期出現(xiàn)障礙，停滯在G0/ G1期的細胞增多，凋亡細胞增加。各組不同時間細胞PI及凋亡率比較見表1。

表1 各組不同時間細胞PI及凋亡率比較(s)

表1 各組不同時間細胞PI及凋亡率比較(s)

注:與空白對照組、陰性質(zhì)粒組同指標比較，*P＜0.05

組別 第1天 第3天 第5天 第7天空白對照組PI 35.68±6.38 36.00±6.21 36.29±7.28 37.81±5.06凋亡率(%) 9.97±3.10 8.51±2.70 9.88±3.34 9.23±3.06陰性質(zhì)粒組PI 37.73±7.19 35.09±4.60 37.85±8.83 38.68±5.98凋亡率(%) 8.90±3.70 7.12±2.97 10.40±4.10 10.71±2.91 hTERT干擾組PI 36.91±5.98 30.72±4.70 31.38±6.65 32.19±7.30凋亡率(%) 5.90±1.79*20.72±7.07*19.14±6.74*18.00±4.73*

3 討論

腦膠質(zhì)瘤具有高度侵襲性，在膠質(zhì)瘤中端粒酶的陽性率隨腫瘤惡性等級升高而相應增加［3］。研究表明，hTERT高表達能通過多分化刺激抑制細胞凋亡，導致細胞永生化。本實驗證明，在膠質(zhì)瘤細胞中，hTERT呈高表達，端粒酶的上調(diào)或重新表達、重新激活是膠質(zhì)瘤無限增殖、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移所必需的，hTERT可作為基因治療膠質(zhì)瘤的理想靶點。

本實驗將重組pSilencer1.0-U6-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞U251，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后第3天目的基因表達明顯下降，直至轉(zhuǎn)染后第7天，目的基因的干擾作用持續(xù)穩(wěn)定。有學者曾使用反義技術、基因敲除技術、核酶切割技術成功地抑制了hTERT的表達，但都存在許多不足，因而限制了這些技術在實驗和臨床上的進一步應用［4］。shRNA是含siRNA的正義和反義鏈的一段序列，中間以7或9個 bp形成環(huán)狀，使siRNA雙鏈配對，在細胞內(nèi)表達后可被DICER切割莖環(huán)產(chǎn)生雙鏈siRNA，這樣的shRNA載體能提供大量siRNA分子。所以shRNA干擾技術具有高度的特異性、普遍性，其沉默效率高、穩(wěn)定性高、操作簡單、重復性好［5］。

本實驗檢測了膠質(zhì)瘤細胞的增殖周期分布與腫瘤細胞的凋亡率，結(jié)果顯示，與對照組相比，目的基因干擾后的細胞進入S期出現(xiàn)障礙，停滯在G0/G1期的細胞增多。證明shRNA抑制了hTERT的表達，降低了端粒酶活性，抑制了細胞從G0期進入S期，激活了啟動凋亡的某些基因，細胞凋亡增加。

RNAi的興起使生物醫(yī)學技術步入嶄新階段，“后基因組時代”對基因功能的分析離不開RNAi，因其沉默機制的廣泛性、高效性和特異性，RNAi可能成為繼單克隆抗體后又一次臨床治療手段的革命，目前探索RNAi治療的研究多集中在感染性疾病和惡性腫瘤，隨著shRNA特異、高效的細胞導入技術成熟，相信不久將看到shRNA成為一種新型藥物而更多地用于臨床治療。

［1］陜聲國，張端蓮，余瑛，等.血管瘤組織中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因表達與端粒酶活性的關系［J］.中華實驗外科雜志，2004，21(6): 661-663.

［2］馬衍剛，傅強，馮晶軍，等.腦膠質(zhì)瘤組織中靶向乏氧誘導因子-1α shRNA表達載體的構(gòu)建與鑒定［J］.山東醫(yī)藥，2007，47 (15):30-31.

［3］劉平，盧亦成，夏放，等.腦膠質(zhì)瘤端粒酶活性的表達及端粒長度的分析［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2000，16(5):316.

［4］Dillin A.The specifics of small interfering RNA specificity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(11):6289-6291.

［5］張峰，劉曄，劉三光，等.RNA干擾研究及其在腫瘤基因治療中的作用［J］.中華實驗外科雜志，2006，23(3):381-382.