α-硫辛酸對糖尿病大鼠下丘腦組織氧化應激及TRX-1、TXNIP的影響

張樹杰，班 博，李艷英，耿厚法

(1天津醫科大學研究生院，天津300070;2濟寧醫學院附屬醫院)

2型糖尿病(T2DM)以葡萄糖和脂類代謝異常為主要特征，氧化應激在DM及其并發癥中發揮重要作用。硫氧化還原蛋白(TRX)系統是分布廣泛的小分子多功能蛋白，作為體內重要的還原系統有多種功能。硫氧還蛋白結合蛋白-2又稱硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)，是氧化應激的介導因子，它可與TRX結合并抑制TRX活性［1］。2010年，我們觀察了α-硫辛酸(LA)對DM大鼠下丘腦組織氧化應激及TRX-1、TXNIP影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠30只，體質量180～200 g(山東省新華魯抗動物實驗中心)。722型分光光度計(上海分析儀器廠)，DYY-8C型凝膠電泳儀(北京六一儀器廠);鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，LA(德國 STADA公司)，丙二醛(MDA)及總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物研究所)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及建模 將大鼠用普通飼料喂養1周后，隨機分為正常對照組10只、實驗組20只。對照組用普通飼料喂養，實驗組用高脂飼料(在60%的基礎飼料中加5%蛋黃粉、20%蔗糖、15%豬油混合)喂養。實驗組飼養4周后，禁食12 h，將STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.2)中，配成濃度1%的溶液，一次腹腔注射30 mg/ kg。72 h后取尾靜脈血檢測血糖，血糖 ＞16.7 mmol/L為DM建模成功。實驗組20只均建模成功，繼續高脂飲食4周后，隨機分為LA組、DM對照組(DC組)各10只;LA組給予LA 120 mg/(kg· d)、干預4周，DC組給予生理鹽水2 ml/d。實驗期間，大鼠自由攝食、飲水，每周測血糖、體質量一次。對照組用等量枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。

1.2.2 MDA、T-AOC檢測 LA干預4周后，各組均禁食12 h，用戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，取下丘腦，將整個下丘腦取出置液氮凍存，再轉入－80℃冰箱凍存。采用RT-PCR法、南京建成生物研究所提供的試劑盒檢測MDA、T-AOC。

1.2.3 TRX、TXNIP mRNA檢測 根據Trizol說明書，從各組下丘腦組織中提取總RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度。在25 μL反應體系中，將1.5 μg的RNA逆轉錄得到cDNA。在20 μL體積的cDNA反應體系中，取1 μL用于擴增。用GADPH作內部參考對照，TRX-1、TXNIP及GADPH基因引物序列及PCR條件見表1。反應條件:94℃5 min，94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃7 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，與DNA標準分子量進行比較，用Biometra凝膠成像系統進行成像和圖像分析，TRX、TXNIP mRNA表達用目的基因條帶與GAPDH條帶灰度值之比表示。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，數據以s表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

表1 TRX-1、TXNIP及GADPH基因引物序列及PCR反應條件

2 結果

2.1 各組下丘腦組織TRX-1、TXNIP mRNA表達比較 見表2。

2.2 各組下丘腦組織MDA、T-AOC比較 見表3。

3 討論

近年研究證實［2］，氧化應激在DM及其慢性并發癥的發生、發展中起重要作用。DM時通過多種途徑導致氧自由基生成增多，從而影響組織細胞的代謝和功能，促進胰島素抵抗發生，導致組織細胞結構和功能損傷。Brownlee［2］認為，DM慢性并發癥如DM大血管病變(心血管、腦血管及下肢血管)、微血管病變(腎臟、神經及視網膜)都有一個共同的發病機制，即氧化應激。

表2 各組下丘腦組織TRX-1、TXNIP mRNA表達比較(相對灰度值，s)

表2 各組下丘腦組織TRX-1、TXNIP mRNA表達比較(相對灰度值，s)

注:與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與DC組比較，*P＜0.01

組別 n TRX-1/GAPDH TXNIP/GAPDH對照組10 0.39±0.13 0.39±0.09 DC組 10 0.58±0.16△ 0.68±0.17△△LA組 10 1.35±0.23* 2.12±0.23*

表3 各組下丘腦組織MDA、T-AOC比較(s)

表3 各組下丘腦組織MDA、T-AOC比較(s)

注:與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與DC組比較，*P＜0.01

組別 n MDA(nmol/mg) T-AOC(U/mg)對照組10 4.72±0.15 2.58±0.11 DC組 10 8.93±0.12△△ 1.15±0.09△△LA組 10 7.59±0.15△△＊ 2.47±0.09△＊

LA是線粒體脫氫酶的重要輔助因子，其可清除氧自由基和活性氧，發揮抗氧化作用，被稱為“萬能抗氧化劑”。動物及臨床研究證實，LA可改善DM氧化應激狀態，對DM慢性并發癥有確切療效。另外，LA也是重要的巰基化合物調節劑，現已證明，其可增加多種組織(包括大腦組織)中的谷胱甘肽和其他內源性抗氧化劑水平［3］。本研究顯示，DM狀態下，大鼠下丘腦組織MDA升高，T-AOC降低;提示DM大鼠的抗氧化能力明顯下降，氧化應激水平明顯升高，與Brownlee［2］研究結果一致。本研究還顯示，LA組下丘腦組織MDA明顯下降，T-AOC明顯升高;提示LA能明顯增強DM大鼠的抗氧化能力，改善其氧化應激能力。

TRX系統是機體重要的抗氧化防御系統，TRX-1是該系統的重要組成部分，是維持細胞內抗氧化防御蛋白還原狀態的重要巰基還原酶，發揮多數巰基還原酶的抗氧化作用［4］。在DM所致的氧化應激增加狀態下，TRX可還原并維持許多蛋白的作用，其抗氧化作用表現在兩個方面［5］:①直接或作為某些過氧化物酶的電子供體清除氧自由基。②作為細胞內巰基還原酶，還原多種蛋白質的二硫鍵，使其恢復生理功能。TXNIP是TRX功能和表達的負性調節因子，通過結合TRX抑制其功能，發揮介導氧化應激的作用［1］。TXNIP是TRX-1的內源性抑制因子，可誘導氧化應激，改變細胞內氧化還原狀態，與DM發生相關［6］。TXNIP與糖代謝和DM發生有密切關系，它可調節糖脂代謝途徑中一些代謝轉錄程序的操縱基因，如PGC-1α、Foxo1、MondoA:Mix復合體［7］，與這些轉錄因子相互作用而調節葡萄糖代謝。研究表明，TXNIP高表達可致胰島β細胞丟失、血糖升高;抑制TXNIP可減少糖毒性引起的胰島β細胞丟失和死亡，延緩DM發生［8］。Lappalainen等［9］研究顯示，DM大鼠下丘腦組織TRX、TXNIP基因轉錄水平明顯升高，但其蛋白水平無明顯變化。本研究發現，DM大鼠用LA干預4周后，其下丘腦組織TRX、TXNIP mRNA表達明顯升高，與文獻報道［9］結果一致。TRX系統是機體抗氧化防御系統的主要部分，是維持細胞內氧化還原穩態的第一線還原系統。因此我們推測，LA改善DM大鼠下丘腦組織氧化應激的作用至少部分是通過誘導DM機體TXNIP轉錄在細胞內平衡中發揮一定的負性作用實現的。

總之，本研究顯示LA可改善DM狀態下的下丘腦氧化應激狀態，其部分機制可能是通過誘導DM機體TXNIP轉錄在細胞內平衡中發揮一定的負性作用實現的。然而，大劑量LA可誘導DM機體TXNIP轉錄，破壞TRX系統平衡，在細胞氧化還原中發揮一定的負性作用。因此，尋找合適的LA治療劑量是下一步研究的重點。

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