不同用藥順序吉非替尼、多西他賽聯(lián)用對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外抑制作用

玄香蘭，周彩存，安昌善

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000;2上海市肺科醫(yī)院)

為了使非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者能從靶向藥物和化療中受益，目前正在尋找靶向治療與化療的最佳聯(lián)合方案和時(shí)機(jī)。2011年，我們觀察了不同順序吉非替尼、多西他賽(DXT)聯(lián)用對(duì)人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9、PC-9/G、A549細(xì)胞周期及凋亡的影響，旨在尋找抑制NSCLC生長(zhǎng)的最佳聯(lián)用方案

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9、PC-9/G、A549(上海肺科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室);DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(鼎國(guó)生物);細(xì)胞凋亡試劑盒(BioVision公司);流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞試劑盒(GenMed Scientifics公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(芬蘭)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將盛有PC-9(EGFR 19外顯子突變吉非替尼敏感株)、PC-9/G(吉非替尼獲得性耐藥)、A549(吉非替尼原發(fā)性耐藥)的液氮凍存管放入37℃水浴箱中快速融化，用PBS洗滌后移入培養(yǎng)瓶，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育，每周換液傳代，保持其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。吉非替尼原料用DMSO稀釋成濃度50 μmol/mL的母液，避光、4℃保存，用藥時(shí)DMSO終濃度小于0.1%。DXT 40 mg/mL避光、4℃保存，配制母液時(shí)以1∶3比例溶于13%乙醇中，加藥后乙醇終濃度小于0.1%。

1.2.2 藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)藥物IC50。取100 μL含細(xì)胞數(shù)5×103個(gè)的細(xì)胞懸液，接種于96孔板;加入100 μL含不同濃度吉非替尼(濃度梯度5～50 μmol/L)或DXT(濃度梯度4～40 μg/mL)的培養(yǎng)液，72 h后每孔加入20 μL MTT 5 mg/mL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，1 200 r/min離心10 min，棄上清;每孔加DMSO 200 μL，置搖床上充分混勻1 h。最后用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)530 nm時(shí)的光密度(OD)值，求出每組平均OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(每組平均OD值－試劑空白/對(duì)照組OD平均值－試劑空白)×100%。用細(xì)胞存活率作出量效曲線，用作圖法得出兩種藥物對(duì)不同細(xì)胞的IC50。

1.2.3 不同用藥順序?qū)?xì)胞存活率的影響 取100 μL含細(xì)胞數(shù)5×103個(gè)的細(xì)胞懸液接種于96孔板。各組用藥順序:G→D組(即吉非替尼→DXT組)先加入100 μL含不同濃度的吉非替尼(PC-9、PC-9/G、A549終濃度分別為0.04、15、30 μmol/L)，24 h后加入10 μL含不同濃度的DXT(PC-9、PC-9/ G、A549終濃度分別為8、18、16 μg/mL)培養(yǎng)液;培養(yǎng)72 h后加入20 μL/孔MTT 5 mg/mL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，1 200 r/min離心10 min，棄上清;每孔加入DMSO 200 μL，搖床上充分混勻后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm時(shí)的OD值，求出每組平均OD值。D→G組先加DXT，后加吉非替尼，PC-9、PC-9/G、A549終濃度同G→D組。G組單用吉非替尼;D組單用DXT;同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(每組平均OD值－試劑空白/對(duì)照組平均OD值－試劑空白)×100%。用細(xì)胞存活率作出直方圖。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 取1×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，24 h貼壁后棄培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，加入3 mL含不同濃度的吉非替尼或DXT培養(yǎng)液;24 h后加100 μL含不同濃度的吉非替尼或DXT培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組、藥物終濃度同細(xì)胞存活率檢測(cè)方法。72 h后，用0.25%胰酶消化收集全部細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清;用冷PBS洗滌2次，加固定液1 mL、4℃固定2 h以上;離心后去上清，用冷PBS洗滌2次，加標(biāo)記液500 μL(500 μL Assay Buffer+10 μL RNase A+10 μL PI)，避光、室溫孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 其檢測(cè)方法同細(xì)胞周期檢測(cè)。加藥72 h后，用0.25%胰酶消化收集全部細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min后棄上清;用冷PBS洗滌2次，加500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞、5 μL Annexin V-PE混勻，避光、室溫反應(yīng)5 min，過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用s表示，細(xì)胞存活率比較用方差分析(oneway ANOVA)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同順序吉非替尼、DXT聯(lián)用對(duì)細(xì)胞存活率的影響 吉非替尼、DXT均能抑制PC-9、PC-9/G、A549生長(zhǎng)，其作用呈濃度依賴性(見圖1～3)。吉非替尼對(duì)PC-9、PC-9/G、A549的IC50分別為(0.05 ±0.008)、(27.2±2.0)、(28.3±0.3)μmol/L，DXT分別為(12.8±1.9)、(21.4±1.1)、(14.5±0.2) μg/mL。各組不同細(xì)胞存活率比較響見表1。

圖1 吉非替尼對(duì)PC-9的存活率—藥物濃度曲線

圖2 吉非替尼對(duì)PC-9/G和A549的存活率—藥物濃度曲線

圖3 DXT對(duì)PC-9、PC-9/G、A549的存活率—藥物濃度曲線

表1 各組細(xì)胞存活率比較(%，s)

表1 各組細(xì)胞存活率比較(%，s)

注:與G組、D組比較，*P＜0.05;與G-D組比較，#P＜0.05

細(xì)胞 G組 D組 G→D組 D→G組PC9 42.1±1.8 45.4±1.8 34.8±0.2* 27.7±0.4*# PC9/G 57.6±0.2 63.8±2.3 50.0±2.9* 41.9±0.5*# A549 58.0±1.7 48.7±1.5 43.6±1.3* 34.5±1.1*#

2.2 不同順序吉非替尼、DXT聯(lián)用對(duì)細(xì)胞周期的影響 G組、G→D組PC-9、PC-9/G、A549的G0～G期細(xì)胞比例均較高，G2～M期細(xì)胞比例較少;D組、D→G組G2～M期細(xì)胞比例均較高，G0～G1期細(xì)胞比例較少。各組細(xì)胞周期細(xì)胞比例比較見表2。

表2 各組細(xì)胞周期細(xì)胞比例比較(%，s)

表2 各組細(xì)胞周期細(xì)胞比例比較(%，s)

注:與G組、G-D組比較，#P＜0.05

細(xì)胞 G組 D組 G→D組 D→G組PC9 G0～G175.7±4.9 20.1±4.5# 73.3±3.4 17.8±6.1# S 10.2±0.4 14.5±7.9 10.5±7.4 13.8±8.5 G2～M 13.6±4.3 65.4±3.5# 16.2±5.9 68.4±10.4# PC9/G G0～G180.0±7.0 19.9±4.6# 71.9±4.7 20.6±5.9# S 6.0±3.3 11.0±4.5 8.1±3.3 19.4±3.8 G2～M 13.8±7.7 69.1±3.1# 20.0±1.6 60.0±4.4# A549 G0～G170.5±8.2 18.0±2.0# 70.5±7.8 18.0±3.9# S 18.1±7.5 11.0±6.9 6.8±0.9 10.0±6.9 G2～M 11.5±1.1 71.0±6.9# 22.7±7.0 72.0±3.8#

2.3 不同順序吉非替尼、DXT聯(lián)用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與G→D組比較，D→G組PC-9、PC-9/G凋亡率明顯升高，A549凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組細(xì)胞凋亡率比較見表3。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較(%，s)

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較(%，s)

注:與G組、G-D組比較，*P＜0.05

細(xì)胞 G組 D組 G→D組 D→G組PC9 15.5±8.7 47.7±9.2*24.8±10.9 51.3±5.7* PC9/G 7.8±1.3 18.0±3.5* 9.2±3.5 21.6±1.1* A549 4.4±4.0 5.5±1.6 5.2±1.3 6.5±0.8

3 討論

吉非替尼是選擇性表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，是最常用的治療NSCLC的分子靶向藥物，對(duì)女性、非吸煙、EGFR突變的腺癌患者療效顯著［1］。DXT是治療NSCLC的一、二線化療藥物。體外研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［2］;DXT可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］;EGFR-TKIs可增強(qiáng)化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［4］。但臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)應(yīng)用吉非替尼、DXT兩類藥物的NSCLC患者生存率并未延長(zhǎng)［5］。

本研究顯示，PC-9、PC-9/G、A549對(duì)吉非替尼和DXT均呈濃度依賴性，藥物濃度越高，細(xì)胞存活率越低;吉非替尼、DXT聯(lián)用抑制細(xì)胞增殖的效果均強(qiáng)于單藥;先用DXT或吉非替尼都有協(xié)同作用，但先用DXT抑制細(xì)胞增殖的效果優(yōu)于先用吉非替尼，其原因可能與兩藥作用機(jī)制不同有關(guān)。吉非替尼可影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，使細(xì)胞增殖阻滯在G0～G1期;DXT主要作用在微管形成階段，使細(xì)胞增殖阻滯在G2～M期。如受到外界因素影響，細(xì)胞生長(zhǎng)周期無(wú)法到達(dá)微管形成階段，DXT就不能完全發(fā)揮抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，這可能是吉非替尼拮抗DXT的原因。本研究顯示，與G→D組比較，D→G組PC-9、PC-9/G細(xì)胞凋亡率明顯升高;提示吉非替尼可促進(jìn)DXT誘導(dǎo)的凋亡，給予DXT前先用吉非替尼，可降低DXT的凋亡，說(shuō)明凋亡可能為兩藥協(xié)同或相互拮抗的原因之一。Mahaffey等［6］研究發(fā)現(xiàn)，單用DXT或者先用DXT、后用厄羅替尼處理的NSCLC細(xì)胞，可明顯表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白;而單用厄羅替尼或先用厄羅替尼、后用DXT處理的細(xì)胞則無(wú)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);提示細(xì)胞凋亡是引起兩類藥物順序差異的重要原因，但其藥物凋亡作用相互拮抗的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

總之，本研究顯示先用DXT、后用吉非替尼是較理想的抑制NSCLC細(xì)胞增殖的最佳聯(lián)用方案，無(wú)論原發(fā)性、獲得性吉非替尼耐藥患者，均可能在此方案中獲得最大利益。

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