急性腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區細胞凋亡與β-catenin、GSK-3β蛋白表達的關系

劉 斌，董曉柳，張文彥，張晉霞

(河北聯合大學附屬醫院，河北唐山063000)

研究表明，缺血腦損傷后存在細胞凋亡，細胞凋亡是腦缺血再灌注(IR)損傷時缺血腦區遲發性神經元死亡的主要形式［1］。Wnt信號通路在許多生理過程中發揮重要作用，參與多種細胞發育和細胞死亡調節［2］。目前，關于Wnt 信號通路的關鍵信號分子β-連環蛋白(β-catenin)和糖原合成酶激酶3β (GSK-3β)蛋白在急性腦IR損傷腦組織細胞凋亡中的作用少見報道。2010～2011年，我們觀察了急性腦IR損傷大鼠海馬CA1區細胞凋亡的表達及其與β-catenin、GSK-3β蛋白表達的關系，旨在探討Wnt通路與缺血性腦損傷的關系，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康雄性SD大鼠36只，體質量200～250 g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供。兔抗大鼠GSK-3β多克隆抗體、兔抗大鼠βcatenin多克隆抗體購自北京博奧森生物公司;原位末端標記(TUNEL)試劑盒購自北京中杉金橋生物公司;SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子量標準蛋白購自華美生物公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及腦IR建模 實驗前，先將大鼠放在室溫(23±2)℃、自然光照下自由進食喂養2周;然后隨機分為假手術組6只、腦IR組30只;腦IR組又分為IR后3、6、24、48、72 h 5個亞組，每組6只。參照改良的Longa法［3］、線栓法制作大鼠大腦中動脈阻斷再灌注模型。各組術前12 h禁食、4 h禁水。大鼠取仰臥位，用10%水合氯醛行腹腔麻醉后，在其頸部行常規縱行切口約25 mm，暴露并鈍性游離右側頸總動脈(CCA)，結扎同側CCA近心端和頸外動脈(ECA)分叉處，并反向拉直ECA;在距CCA末端約5.0 mm處剪口，將直徑0.26 mm的魚線沿頸內動脈(ICA)方向插入，遇阻力后稍退0.5 mm，插入深度由ECA分叉處計算約18.5 mm;在ICA近心端結扎該動脈，全層縫合切口，2 h后拔出魚線實現再灌注，術中室溫保持(22±2)℃。腦IR建模成功的標志為大鼠蘇醒后左側肢體癱瘓，提尾時左前肢內收屈曲，爬行時左側劃圈。假手術組線栓插入深度小于9.0 mm，不閉塞大腦中動脈。

1.2.2 腦組織標本制備 在規定時間內，用多聚甲醛經大鼠心臟灌注、固定后取腦。取海馬部位腦組織，先后行常規乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、連續切片5 μm厚，再置60℃烤箱烘烤0.5 h，直至載玻片上的蠟呈淚滴狀流下。

采用Western blotting蛋白印跡法制作標本，用10%水合氯醛對大鼠進行深度麻醉。斷頭后于冰上開顱取腦，用冷PBS漂洗殘余血，立即分離新鮮海馬，將海馬組織置于15 mL離心管中，12 000 r/min離心15 s;加入4℃預冷的組織裂解液，振蕩混勻、作用30 min后，將細胞懸液置4℃低溫離心12 000 r/min，離心10 min后取上清液4℃保存。經蛋白定量后分裝，用4℃預冷的PBS調整蛋白濃度為750 μg/mL，加等體積上樣緩沖液，在沸水中至少煮5 min，置于4℃備用。

1.2.3 細胞凋亡檢測 取海馬組織標本，經DAB顯色、蘇木素輕度復染后，采用TUNEL法、TUNEL試劑盒提供的步驟檢測各組細胞凋亡情況。細胞凋亡陽性標準:細胞核中有棕黃色顆粒為陽性細胞。

1.2.4 β-catenin、GSK-3β蛋白陽性細胞檢測 取制備好的海馬組織標本，加入正常羊血清封閉液中，先后滴加一抗4℃過夜、滴加二抗和適量辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，進行DAB顯色。采用免疫組化法，按試劑說明書操作要求檢測各組β-catenin、GSK-3β蛋白表達。細胞質著棕黃色為陽性細胞。

1.2.5 β-catenin、GSK-3β蛋白表達量檢測 采用Western blotting蛋白印記法檢測β-catenin、GSK-3β蛋白表達量。取各組制備好的海馬組織20 μg，在100 g/L十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，電轉移至硝酸纖維素膜，以標準蛋白Marker為參照，根據相對分子質量大小切取相應條帶，分別加入兔抗大鼠 β-catenin一抗(1∶175)、兔抗大鼠GSK-3β一抗(1∶175)，4℃過夜。次日，在室溫放置20 min、用 TBST洗滌，分別與生物素標記二抗(1∶200)室溫下孵育0.5 h，TBST洗滌，與卵白素—辣根過氧化物酶復合物室溫下孵育0.5 h，DAB顯色。實驗重復3次，以β-actin作為內參，進行特異性蛋白條帶掃描;在同一條件下，應用CMIAS真彩醫學圖像分析系統測定條帶光密度值，其與β-actin灰度值的比值為目的蛋白的相對表達量。

1.2.6 圖像分析 選定各組缺血側海馬CA1區，用CMIAS真彩色醫學圖像免疫組化自動分析系統計數陽性細胞。在200倍光鏡下觀察切片，隨機取6個視野，計數每個視野海馬CA1區長度為1 mm的陽性細胞數，以平均值代表各區陽性數結果。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，數據以s表示，兩組間均數比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析和SNK-q檢驗，兩變量間關系分析用Spearman秩和相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡數、GSK-3β蛋白、GSK-3β蛋白表達陽性數比較 術后24 h，假手術組海馬CA1區可見凋亡陽性細胞。IR組IR 3 h即出現凋亡細胞，隨著IR時間延長逐漸增加，至48 h達高峰，72 h開始減少。與假手術組比較，IR組各時間點的細胞凋亡數明顯增多(P均＜0.01)。見表1。術后24 h，假手術組海馬CA1區可見β-catenin、GSK-3β蛋白表達。IR組各時間點均可見β-catenin、GSK-3β蛋白表達，從3 h即出現，48 h達高峰，72 h開始減少。與假手術組比較，IR組各時間點細胞凋亡數、GSK-3β蛋白陽性數明顯增加(P均＜0.01)，β-catenin蛋白陽性數均增加，但無統計學差異(P均＞0.05)。見表1。

表1 各組細胞凋亡數、β-catenin蛋白、GSK-3β蛋白表達陽性數比較(個，s)

表1 各組細胞凋亡數、β-catenin蛋白、GSK-3β蛋白表達陽性數比較(個，s)

注:與假手術組比較，*P＜0.01

組別 n 細胞凋亡 β-catenin GSK-3β IR 3 h 6 16.33±1.63* 3.07±1.50 9.47±1.92* IR 6 h 6 18.33±1.75* 3.14±1.08 9.92±1.09* IR 24 h 6 21.67±2.16* 3.26±0.88 11.08±0.89* IR 48 h 6 25.83±1.47* 3.47±0.94 11.21±1.56* IR 72 h 6 23.83±0.98* 3.19±1.02 10.58±1.64假手術組*

2.2 各組β-catenin、GSK-3β蛋白表達量比較 假手術組海馬CA1區可見β-catenin、GSK-3β蛋白表達;IR組再灌注3 h β-catenin、GSK-3β蛋白表達量升高，再灌注48 h達高峰，72 h開始下降。與假手術組比較，IR組各時間點的β-catenin蛋白表達量明顯升高(P均＜0.01);GSK-3β蛋白表達量升高，但無統計學差異(P均＞0.05)。見表2。

表2 各組β-catenin、GSK-3β蛋白表達量比較(s)

表2 各組β-catenin、GSK-3β蛋白表達量比較(s)

注:與假手術組比較，*P＜0.01

組別 n β-catenin GSK-3β 6 0.99±0.18 1.18±0.02 IR組IR 3 h 6 1.01±0.29* 1.34±0.09 IR 6 h 6 1.10±0.12* 1.40±0.07 IR 24 h 6 1.11±0.17* 1.48±0.02 IR 48 h 6 1.16±0.22* 1.62±0.09 IR 72 h 6 1.06±0.23*假手術組1.43±0.07

2.3 相關性分析 對IR組大鼠的β-catenin、GSK-3β蛋白表達與細胞凋亡情況進行相關性分析，結果顯示，大鼠腦IR后各時間點的細胞凋亡數與GSK-3β蛋白陽性表達數呈正相關(r=0.300，P＜0.05)，與β-catenin蛋白陽性表達數無相關性(r=0.160，P＞0.05)。

3 討論

研究表明，細胞凋亡機制參與腦 IR損傷［4］。腦缺血時細胞凋亡機制非常復雜，其發生過程受多種蛋白和基因調控。調控腦細胞發育的關鍵信號傳導通路包括Wnt信號通路、Hh信號通路、Notch信號系統及神經營養因子家族等，Wnt信號在中樞神經系統發育中起關鍵作用，對中樞神經系統軸線形成、海馬發育、大腦皮質模式形成及細胞分化等均有重要作用;而且該信號通路還與其他信號系統相互作用，共同影響神經元發生、神經前體細胞分化、神經突觸誘導、細胞周期調控及細胞凋亡調節等［5］。

β-catenin、GSK-3β蛋白是Wnt信號通路經典途徑的兩個關鍵信號分子。β-catenin在經典的Wnt信號通路中處于中心地位，其激活或降解會導致Wnt信號通路變化［6］。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過激活糖原合成酶調節細胞能量代謝過程，在細胞的生長、分化、突變和凋亡等生命活動中具有重要的調控作用，是多種信號途徑的交匯點，具有廣泛的底物(包括多種轉錄因子)［7］，參與多種信號的負調控。研究表明，在多種正常組織細胞及多類腫瘤細胞中，GSK-3β活性上調可進一步激活細胞凋亡的相關蛋白激酶BAX、c-jun、Caspases家族［8，9］，從而誘導細胞凋亡。在心肌、腦缺血損傷中，GSK-3β活性增強可促進IR損傷臟器中的細胞凋亡［10］。大量研究證實，缺血可激活GSK-3β，GSK-3β表達增強可誘導細胞早期凋亡。本研究顯示，IR組大鼠缺血側海馬CA1區可見細胞凋亡明顯，GSK-3β蛋白表達明顯增多，且GSK-3β蛋白表達數與細胞凋亡數呈正相關;而β-catenin蛋白表達則與假手術組無統計學差異。本研究結果與文獻報道基本一致，進一步說明Wnt信號通路在腦IR損傷中可能發揮重要作用，GSK-3β蛋白對缺血性腦損傷的細胞凋亡起促進作用。

綜上所述，Wnt信號通路的確參與了大鼠缺血性腦損傷過程，且該通路對細胞凋亡過程有促進作用。提示調節Wnt信號轉導通路、修復腦缺血損傷，可能成為今后干預腦IR損傷的新途徑。

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