蛻皮甾酮對2型糖尿病大鼠腎組織氧化應激的影響

鄒德平，許志忠，曹 靈，陳 秋

(1眉山市人民醫院，四川眉山620010;2瀘州醫學院附屬醫院; 3成都中醫藥大學附屬醫院)

糖尿病腎臟疾病(DKD)是糖尿病(DM)最常見且嚴重的并發癥，也是DM患者的主要死因之一。目前，在我國終末期腎功衰竭患者中DKD不斷增加。因此，對DKD患者早期診治尤為重要。研究發現，氧化應激在DKD的發生、發展中起重要作用，抗氧化應激是防治DKD的重要途徑之一。研究表明，蛻皮甾酮有促進蛋白質合成、影響糖脂代謝、抗氧化應激等作用［1］。為探討蛻皮甾酮防治DKD的可能機制，2010年11月～2011年6月，我們進行了相關研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠70只，6～7周齡，體質量140～160 g，由瀘州醫學院動物實驗中心提供。蛻皮甾酮(昆明昌寧德康公司)，阿托伐他汀(輝瑞制藥公司)，洛汀新(北京諾華公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國)。超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(美國)。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿病(T2DM)模型建立 將70只大鼠適應性喂養1周，采用隨機數字表法將其分為T2DM建模組(建模組)60只和正常對照組(對照組)10只。對照組用普通飼料喂養，建模組用高脂飼料喂養，均8周。第9周時，所有大鼠禁食16 h，其中建模組、對照組分別腹腔注射STZ 25 mg/kg、枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液5 mL/kg;第10周時，隨機選擇建模組48只，在禁食8 h過夜后，取尾靜脈血檢測空腹血糖(FPG)。FPG 7.8～15.6 mmol/L確定為T2DM建模成功。

1.2.2 動物分組及藥物干預 采用隨機數字表法，將48只T2DM建模大鼠分為A組、B組、C組、T2DM組各12只。建模第2天，前三組分別將蛻皮甾酮20 mg/(kg·d)、阿托伐他汀2 mg/(kg·d)、吡格列酮20 mg/(kg·d)加入生理鹽水2 mL中灌胃，T2DM組、對照組用等量生理鹽水灌胃。藥物干預期間，各組均自由攝食、飲水。

1.2.3 標本制作 實驗第15周末，各組禁食8 h過夜，收集8 h尿。繼之用1%戊巴比妥溶液腹腔注射進行麻醉并固定于手術臺，常規消毒后，開胸行心臟穿刺取血5～10 mL，置4℃冰箱保存;開腹經腎蒂取下腎臟，行冠狀面正中剖開，將1/2腎臟置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定，24 h內經梯度乙醇脫水，制作石蠟包塊。

1.2.4 血、尿指標檢測 采用酶法檢測FPG;全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血脂;免疫散射速率比濁法檢測尿白蛋白(Alb)，計算尿肌酐清除率(Ccr)。

1.2.5 腎組織NOS、SOD、MDA檢測 采用ELISA法準確稱取各組腎組織0.1 g，勻漿后加PBS液1.0 mL，－20℃過夜;次日經兩次凍融后行5 000 r/min離心，取上清液，分別按NOS、SOD、MDA試劑盒說明書操作。測得樣品OD值，以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，計算標準曲線的直線回歸方程;再根據樣品OD值，計算樣品的NOS、SOD、MDA值。

1.2.6 腎組織光鏡檢查 將各組石蠟包埋的腎組織蠟塊切成4 μm厚切片，用HE染色后，在光鏡下觀察其腎組織變化。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，數據以s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組BUN、SCr、FPG、Ccr比較 見表1。

2.2 各組血脂比較 見表2。

表1 各組BUN、SCr、FPG、Ccr比較(s)

表1 各組BUN、SCr、FPG、Ccr比較(s)

注:與對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與T2DM組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 n BUN(mmol/L) SCr(μmol/L) FPG(mmol/L) Ccr(mg/g)對照組 10 6.50±0.63 31.40±4.69 6.70±0.53 19.19±6.93 T2DM組 12 10.04±0.65＊＊ 21.16±3.52＊＊ 12.87±2.71＊＊ 145.93±26.93＊＊A組 12 8.21±1.35＊▲▲ 27.19±2.17＊▲▲ 9.48±2.34＊▲▲ 46.33±12.96＊▲▲B組 12 8.89±0.89＊▲▲ 23.89±3.05＊▲ 12.32±2.12＊＊ 68.61±19.22＊▲▲C組 12 8.21±1.25＊▲▲ 28.77±2.56▲▲ 9.08±2.08＊▲▲ 51.46±16.81＊▲▲

表2 各組血脂比較(mmol/L，s)

表2 各組血脂比較(mmol/L，s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與T2DM組比較，▲P＜0.01

對照組10 1.32±0.06 0.66±0.03 1.04±0.06 0.66±0.04 T2DM組12 2.34±0.18* 2.27±0.11* 0.68±0.04* 1.12±0.06* A組 12 1.84±0.15＊▲1.70±0.18＊▲0.94±0.09＊▲0.86±0.09＊▲B組 12 1.37±0.17▲ 1.11±0.17＊▲0.98±0.06▲ 0.92±0.05＊▲C組 12 2.25±0.23* 2.21±0.15* 0.84±0.10＊▲1.08±0.06*

2.3 各組腎組織NOS、SOD、MDA比較 見表3。

表3 各組腎組織NOS、SOD、MDA比較(pg/mL，s)

表3 各組腎組織NOS、SOD、MDA比較(pg/mL，s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與T2DM組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 n NOS SOD MDA對照組10 940±89.8 453±80.2 523±52.4 T2DM組12 1 636±116.9* 180±42.3* 1 393±76.7* A組 12 1 098± 52.7＊▲▲ 368±48.0＊▲▲ 958±60.6＊▲B組 12 1 423± 74.9＊▲▲ 289±48.3＊▲▲ 1 195±75.3＊▲C組 12 1 240± 72.1＊▲▲ 329±47.7＊▲▲ 1 145±75.3＊▲

2.4 各組腎臟及腎組織變化 與對照組比較，肉眼發現各建模組腎臟體積增大、顏色深，剖面皮質增厚;光鏡下可見腎小球系膜細胞和腎小管細胞增生、肥大，胞質增多，胞核染色加深，毛細血管袢狹窄。上述改變以A組、C組較輕，B組較重，T2DM組最重。

3 討論

DKD的確切發病機制尚未明確，目前認為，遺傳、代謝、血流動力學變化、氧化應激、激素及多種細胞因子共同參與導致DKD發生、發展。研究表明，腎小球肥大是DKD最早且最明顯的腎臟病理變化，微量白蛋白尿是其早期主要臨床表現。DM患者尿微量白蛋白排泄增加，提示其腎臟血管內皮損害，是診斷早期DKD的金指標［2］。目前，防治DKD蛋白尿進展的主要手段是控制血糖、血壓、血脂等。研究證實，血管緊張素轉換酶抑制劑有獨立于降壓以外的腎臟保護作用，廣泛用于DKD的防治。蛻皮甾酮是節肢動物產生的具有蛻皮活性的激素，以往我們研究發現，蛻皮甾酮可減輕T2DM大鼠的腎臟病理改變，降低其尿蛋白［3］。本次研究結果與其相似。

DM時機體處于氧化應激狀態，常產生過多的氧自由基［4］。當活性氧簇生成增加而不能完全清除時，細胞內的一些不穩定分子(如脂質、蛋白質、DNA等)易被氧化，使其結構發生改變而造成功能異常。MDA是反映氧自由基脂質過氧化的指標之一，其在腎臟固有或由循環中的炎癥細胞產生。檢測DM大鼠的腎臟MDA，可了解其腎氧化應激情況［5］。SOD具有清除多種氧自由基的能力，檢測其變化可間接反映機體的抗氧化能力。Bhatia等［6］報道，抗氧化治療能減少DM大鼠的Alb排泄。Cai等［7］研究表明，蛻皮素具有抗氧化和清除自由基作用，口服蛻皮素0.1 mg/(kg·d)30 d以上可降低細胞膜的脂質氧化反應。本研究顯示，與T2DM組比較，A組腎組織MDA明顯降低，SOD明顯升高;說明蛻皮甾酮可能通過增加腎組織SOD、減少MDA，減輕T2DM大鼠的腎組織氧化應激水平，發揮腎臟保護作用。

Prabhakar［8］報道，NO的代謝參與內皮依賴性血管舒張(EDVR)和組織損傷機制，EDVR作用減弱在DKD及其微血管并發癥的發生、發展中起重要作用。體內NO生成的主要限速因素是NOS，臨床上常根據患者的NOS水平判斷其NO的分布和量。本研究顯示，與T2DM組比較，A組NOS明顯降低;表明蛻皮甾酮可能通過抑制早期DKD大鼠的腎組織NOS表達，起到腎臟保護作用。T2DM大鼠的特點是胰島素抵抗及高脂血癥并存，治療上應改善胰島素抵抗、降血脂。本研究顯示，蛻皮甾酮可降低T2DM大鼠的血脂、FPG，減少Alb排泄及抗氧化應激，減輕腎臟損傷。提示蛻皮甾酮可能成為今后防治DKD的新型藥物。

綜上所述，在DM治療過程中，除嚴格控制血糖、血脂外，定期檢測血清SOD、MDA等，采取有效措施進行臨床干預，對保護DM患者的腎損傷可能具有重要意義。

［1］鄒德平，曹靈，陳秋.蛻皮素藥理學作用的研究進展［J］.中國新藥雜志，2008，17(5):371-374.

［2］Juliane I，Themis Z，Joiza LC，et al.Evaluation of tests for microalbuminuria SCr-eening in patients with diabetes［J］.Nephrol Dial Transplant，2005，20(5):2402-2407.

［3］鄒德平，許志忠，曹靈，等.蛻皮甾酮對實驗性糖尿病大鼠腎組織氧化應激的影響［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2010，11(1): 28-30.

［4］Iino K，Iwase M，Sonoki K，et al.Combination treatment of vitamin C and desferrioxamine suppresses glomerular superoxide and prostaglandin E production in diabetic rats［J］.Diabetes Obes Metab，2005，7(1):106-109.

［5］Lee EY，Lee MY，Hong SW，et al.Blockade of oxidative stress by vitamin C ameliorates albuminuria and renal sclerosis in experimental diabetic rats［J］.Med J，2007，48(5):847-855.

［6］Bhatia S，Shukla R，Venkata S，et al.Antioxidant status，lipid peroxidation and nitric oxide end products in patients of type 2 diabetes mellitus with nephropathy［J］.Clin Biochem，2003，36(7): 557-562.

［7］Cai YJ，Dai JQ，Fang JG，et al.Antioxidative and free radical scavenging effects of ecdysteroids from Serratula strangulate［J］.Can J Pharmacol，2001，80(12):1187-1194.

［8］Prabhakar SS.Role of nitric oxide in diabetic nephropathy［J］.Nephrol，2004，24(4):333-344.