BRL37344對3T3-L1脂肪細胞脂肪分解與脂肪因子表達的影響

岳 杉，耿厚法，班 博

(1天津醫科大學研究生院，天津300070;2濟寧醫學院附屬醫院)

肥胖是糖尿病、高血壓、冠心病等多種疾病的共同危險因素，近10余年肥胖率呈上升趨勢，開發抗肥胖藥物是目前國際研究的熱點。研究顯示，β3腎上腺素受體激動劑(β3ARa)對肥胖嚙齒類動物有良好的抗肥胖作用，可降低其體脂含量。BRL37344是選擇性β3ARa，其可通過降低體脂含量顯著降低肥胖ob/ob小鼠的體質量，且不影響食物攝入［1］。目前，脂肪組織作為內分泌器官已逐漸成為共識，瘦素、TNF-α是與脂代謝密切相關的脂肪細胞因子。為探討BRL37344減輕體質量、改善脂代謝的作用機制，2010～2011年，我們觀察了BRL37344對3T3-L1細胞脂肪分解與脂肪因子表達的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1前脂肪細胞株購自中國科學院細胞庫;BRL37344、胰島素、IBMX購自Sigma公司; DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司;甘油測定試劑盒購自北京普利來公司;Trizol試劑購自Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒購自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物干預 將3T3-L1前脂肪細胞置于含10%FBS的DMEM培養基，在37℃、5% CO2培養箱中培養，2～3 d換液一次，直至細胞單層融合至80%以上進行傳代培養。以5×104個/孔密度接種于6孔培養板，用含10%FBS的DMEM培養基繼續培養，待細胞生長融合后2 d，換用含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松及0.86 μmol/L胰島素的DMEM培養基;誘導細胞分化48 h后，換用含1 μmol/L地塞米松及0.86 μmol/L胰島素的培養基繼續培養，2 d換液一次。誘導分化后10 d左右，3T3-L1前脂肪細胞80%以上呈成熟脂肪細胞表型，可用于實驗［2］。細胞分化成熟后，分別用濃度0、10－9、10－7mol/L的BRL37344干預48 h，或用10－7mol/L的BRL37344干預0、12、24、48 h;觀察BRL37344對待測指標的時間與劑量效應，收集細胞及培養基于－80℃凍存。

1.2.2 甘油釋放含量檢測 采用酶法檢測培養基中的甘油釋放含量，作為評價脂肪分解的指標。將50 μL DMEM培養液加入750 μL甘油測定液中，37℃、20 min后進行比色，計算待測樣品的甘油含量［3］。

1.2.3 瘦素、TNF-αmRNA檢測 采用RT-PCR法檢測脂肪細胞中的瘦素、TNF-α mRNA，Trizol法提取3T3-L1脂肪細胞的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度與A260/A280比值。經瓊脂糖電泳顯示為28、18、5 s三條清晰帶，A260/A280比值均大于1.8。定量后取總RNA 1.5 μg，以Oligo 18為引物進行逆轉錄反應，反應體系20 μL。取逆轉錄產物1 μL為模板進行PCR擴增，PCR反應體系25 μL。引物由上海生工生物工程研究所合成，RT-PCR引物序列及反應條件(略)。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用UVP凝膠密度掃描儀對各基因特異性擴增產物的電泳條帶進行密度掃描，用Labwork3.0軟件分析電泳條帶的凈光密度值，目的基因mRNA表達以該基因條帶密度與β-actin基因條帶密度的比值表示。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以s表示，進行t檢驗和方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度BRL37344對3T3-L1脂肪細胞甘油釋放含量的影響 BRL37344濃度為0、10－9、10－7mol/L時，甘油釋放含量分別為(1.337±0.057)、(1.780±0.133)、(2.698±0.110)μmol/L。與0濃度比較，BRL37344 10－9、10－7mol/L時的甘油釋放含量分別增加33%、102%(P＜0.05或＜0.01)。

2.2 不同時間BRL37344對3T3-L1脂肪細胞甘油釋放含量的影響 10－7mol/L的BRL37344干預0、12、24、48 h后，甘油釋放含量分別為(1.319± 0.053)、(1.402±0.112)、(1.973±0.098)、(2.747 ±0.125)μmol/L。與BRL37344干預時間0比較，其干預12、24、48 h后的甘油釋放含量分別增加6%、50%、95%(P＜0.05或＜0.01)。

2.3 不同濃度BRL37344對3T3-L1脂肪細胞瘦素、TNF-α mRNA表達的影響 見表1。與0濃度比較，BRL37344 10－9、10－7mol/L時瘦素mRNA表達量分別降低38%、97%(P＜0.05或＜0.01)，TNF-α mRNA表達量分別降低65%、130%(P＜0.05或＜0.01);呈劑量依賴性。

表1 不同濃度BRL37344對3T3-L1脂肪細胞瘦素、TNF-α mRNA表達的影響(s)

表1 不同濃度BRL37344對3T3-L1脂肪細胞瘦素、TNF-α mRNA表達的影響(s)

注:與0 mol/L比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

BRL37344濃度 瘦素mRNA TNF-αmRNA 0 mol/L 1.281±0.302 1.359±0.512 10－9mol/L 0.928±0.241* 0.824±0.326* 10－7mol/L 0.650±0.172＊＊ 0.591±0.211＊＊

2.4 不同時間BRL37344對3T3-L1脂肪細胞瘦素、TNF-α mRNA表達的影響 見表 2。與BRL37344干預時間0比較，其干預12、24、48 h后瘦素mRNA表達量分別降低6%、48%、119%(P分別＞0.05、＜0.05、＜0.01)，TNF-α mRNA表達量分別降低10%、66%、158%(P分別＞0.05、＜0.05、＜0.01);呈時間依賴性。

表2 不同時間BRL37344對3T3-L1脂肪細胞瘦素、TNF-α mRNA表達的影響(s)

表2 不同時間BRL37344對3T3-L1脂肪細胞瘦素、TNF-α mRNA表達的影響(s)

注:與0 h比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

BRL37344干預時間 瘦素mRNA TNF-αmRNA 0 h 1.382±0.395 1.494±0.449 12 h 1.304±0.302 1.358±0.365 24 h 0.934±0.257* 0.901±0.330* 48 h 0.631±0.275＊＊ 0.579±0.235＊＊

3 討論

肥胖是高血壓、糖尿病、冠心病等疾病的共同危險因素，據WHO報道，2015年全球肥胖及超體質量人群預計增至23億。因此，開發抗肥胖藥物日益受到重視。β3腎上腺素受體主要分布于棕色、白色脂肪組織，參與調節機體的脂肪分解和產熱;β3ARa通過激活β3受體、促進白色脂肪組織的脂肪分解和棕色脂肪組織的非顫栗性產熱而減輕體質量，為治療肥胖癥提供了新的思路。

肥胖常伴隨脂肪分解過程改變，包括機體對刺激性脂肪分解反應減弱，導致甘油三酯利用減少，從而加重肥胖，形成惡性循環［4］。因脂肪細胞中的甘油三酯水解后，按比例釋放甘油和游離脂肪酸，故本研究將測定培養基中的甘油釋放含量作為評價脂肪分解的指標。本研究結果顯示，BRL37344能顯著增加脂肪細胞的脂肪分解，且隨濃度及作用時間增加而逐漸增強;提示BRL37344能增加脂質分解，減少細胞內的脂質含量，減輕體質量。Kinney等［5］研究證實，BRL37344能顯著增加肥胖C57BL/6小鼠附睪脂肪組織分解及游離脂肪酸氧化，減輕體脂含量。本研究結果與其結果一致。Candelore等［6］研究發現，BRL37344并未顯著改變中國倉鼠卵巢細胞的脂肪分解。上述研究的差異可能與實驗模型、方法及干預時間等有關。

脂肪組織是能量儲存器官，也是人體最大的內分泌組織，其分泌的許多脂肪細胞因子對體內能量平衡有不可或缺的作用。瘦素是目前研究最深入的脂肪細胞因子，主要表達于白色脂肪組織，是肥胖ob基因的表達產物，主要作用于下丘腦能量代謝調節中樞，通過抑制食欲、增加能量消耗，減輕體質量。Kim等［7］發現，在3T3-L1前脂肪細胞分化成熟過程中，瘦素能刺激脂肪酸氧化，抑制CAAT，增強子結合蛋白-α與過氧化物酶體增殖物活化受體表達，減少細胞內甘油三酯積聚，抑制脂肪細胞生長發育。TNF-α是前炎癥細胞因子，由脂肪細胞、單核巨噬細胞等產生;它是一種多功能細胞因子，與糖脂代謝密切相關。Chae等［8］研究推斷，TNF-α通過激活NF-κB信號通路抑制脂肪細胞分化，使分化好的脂肪細胞逆向轉變，包括細胞內脂質積聚減少、形態上由圓形轉為長梭形等。此外，TNF-α可增加脂肪分化相關蛋白表達和脂滴包被蛋白磷酸化，促進脂肪分解。以上研究提示，在脂肪細胞脂代謝方面，增加瘦素、TNF-α mRNA表達有利于抑制脂肪細胞增殖及肥胖發生。然而與正常人相比，肥胖者脂肪組織常表達更多的瘦素及TNF-α，多項體外實驗證實，脂肪細胞體積及數量增加與瘦素、TNF-α表達水平呈正相關［9］。肥胖伴隨瘦素、TNF-α抵抗，體脂含量增加時，機體反饋性增加瘦素、TNF-α表達和分泌，加重抵抗狀態。本研究顯示，BRL37344可抑制3T3-L1脂肪細胞內的瘦素、TNF-α mRNA表達量，呈劑量與時間依賴性;提示BRL37344能增加脂肪細胞對瘦素、TNF-α的敏感性，改善其抵抗引起的代謝紊亂，促進其減重作用發揮，BRL37344與脂肪細胞內分泌功能間的相互作用也是藥效產生的基礎。

綜上所述，BRL37344可促進脂肪細胞的脂質分解，抑制瘦素、TNF-α mRNA表達，其抗肥胖作用與促進脂肪分解，改善瘦素、TNF-α抵抗狀態有關。3T3-L1脂肪細胞內瘦素、TNF-α mRNA表達量降低的確切原因有待進一步研究。

［1］Hashimoto K，Nagao Y，Ida K，et al.Improvement of metabolic disorders and visceral fat obesity by the beta 3-adrenoceptor agonist BRL35135A in genetically obese rodents［J］.Biochem Pharmacol，1996，52(10):1529-1535.

［2］Ramanjaneya M，Chen J，Brown JE，et al.Identification of nesfatin-1 in human and murine adipose tissue:a novel depot-specific adipokine with increased levels in obesity［J］.Endocrinology，2010，151(7):3169-3180.

［3］He J，Jiang H，Tansey JT，et al.Calyculin and okadaic acid promote perilipin phosphorylation and increased lipolysis in primary rat adipocytes［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1761(2):247-255.

［4］Duncan RE，Ahmadian M，Jaworski K，et al.Regulation of lipolysis in adipocytes［J］.Annu Rev Nutr，2007，27(1):79-101.

［5］Kinney BP，Qiao L，Levauqh JM，et al.B56alpha/protein phosphatase 2A inhibits adipose lipolysis in high-fat diet-induced obese mice［J］.Endocrinology，2010，151(8):3624-3632.

［6］Candelore MR，Deng L，Tota L，et al.Potent and selective human beta(3)-adrenergic receptor antagonists［J］.J Pharmacol Exp T-her，1999，290(2):649-655.

［7］Kim WK，Lee CY，Kang MS，et al.Effects of leptin on lipid metabolism and gene expression of differentiation-associated growth factors and transcription factor during differentiation and maturation of 3T3-L1 preadipocytes［J］.Endocr J，2008，55(5):827-837.

［8］Chae GN，Kwak SJ.NF-kappaB is involved in the TNF-alpha induced inhibition of the differentiation of 3T3-L1 cells by reducing PPARγ expression［J］.Exp Mol Med，2003，35(5):431-437.

［9］Zhang Y，Guo KY，Diaz PA，et al.Determinants of leptin gene expression in fat depots of lean mice［J］.Am J Physiol Regul Inteqr Comp Physiol，2002，282(1):226-234.