Kisspeptin-GPR54-GnRH神經元軸在雌性大鼠中樞性性早熟中的作用

王海蓮，葛 偉，薛 江

(1山東大學第二醫院，濟南250033;2山東大學齊魯醫院)

性早熟是一種以青春期發育提前出現為特征的生長發育異常性疾病，是常見小兒內分泌疾病之一。性早熟分為中樞性、外周性兩類，中樞性性早熟(CPP)又稱為真性性早熟，多因下丘腦視前內側核及弓狀核分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)過多所致。近年研究發現，KISS-1基因產物Kisspeptin及其受體G蛋白偶聯受體54(GPR54)對GnRH釋放和青春期啟動起重要作用，Kisspeptin/GPR54信號在青春期發生、發展中的作用受到廣泛關注。目前，關于Kisspeptin/GPR54信號與CPP關系的研究較少。2010～2011年，本實驗以N-甲基-DL-天冬氨酸(NMA)建立雌性大鼠CPP模型，檢測其不同發育期下丘腦中KISS-1 mRNA、GPR54 mRN、GnRH mRNA的表達，以探討Kisspeptin-GPR54-GnRH神經元軸在雌性大鼠CPP中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 NMA(購自Sigma公司)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis試劑盒(購自 MBI公司)，SYBR Green Real-Time PCR Master Mix試劑盒(購自TOYOBO公司)。26日齡雌性SD大鼠50只，體質量55～70 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。飼養條件為室溫20～26℃，每日固定光照14 h。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及分組 將50只大鼠隨機分為對照1組(正常青春前期)、對照2組(正常青春早期)、對照3組(正常青春中期)、實驗1組(性早熟青春早期)、實驗2組(性早熟青春中期)各10只。自大鼠26日齡起至陰道口開放(VO)之日，實驗組皮下注射NMA 40 mg/kg、每日2次，使其青春期提前;對照組皮下注射生理鹽水0.2 ml/d。用藥后，觀察對照2、3組和實驗組的VO情況。對VO大鼠每日行陰道細胞涂片，觀察其性周期(順序為發情期、發情后1期、發情后2期、發情間期、發情前期)變化和第1個發情間期(D1)出現時間。實驗1組出現第1個發情前期時稱體質量后斷頭處死，按1∶1比例同時處死對照1組;對照2組出現第1個發情前期、對照3組及實驗2組出現第2個發情前期時均稱體質量后斷頭處死。

1.2.2 黃體生成素(LH)檢測 各組處死前，先用毛細管經其內眥靜脈叢采血1 mL，分離血清后置于－20℃凍存，采用過夜溫育放免法檢測血清LH。

1.2.3 下丘腦組織超微結構觀察 各組處死取下丘腦后，參照大鼠腦定位圖譜，在其弓狀核平面取1 mm×1 mm×1 mm組織，用4%戊二醛液固定48 h后，在電子顯微鏡下觀察其超微結構。

1.2.4 性腺和性器官檢測 各組處死后取其子宮及雙側卵巢，稱量濕重后用10%甲醛液固定。對卵巢標本行常規石蠟切片(取最大截面)，HE染色，在光鏡下觀察卵巢黃體出現個數。對子宮標本行常規石蠟切片(取垂直橫斷面)，HE染色后，在光鏡下用病理切片計算機圖像自動分析系統測量子宮壁厚度。根據器官指數=器官濕重/體質量的公式，計算卵巢指數與子宮指數。

1.2.5 KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA檢測 采用Real-Time RT-PCR法檢測各組下丘腦中的KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA表達。用Trizol試劑、一步法從下丘腦組織中提取總RNA，紫外線分光光度計測定其RNA濃度和純度; OD260/OD280為1.8～2.0。以總RNA為模板，根據RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒說明合成cDNA，逆轉錄條件為25℃10 min，37℃60 min，95℃ 5 min。采用 Primer5軟件設計引物(略)，引物由 Invitrogen公司合成。根據 SYBR Green Real-Time PCR Master Mix試劑盒說明，檢測KISS-1、GPR54基因表達。反應體系包括2×Mix、Taq聚合酶、正向引物、反向引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，加入ddH2O至20 μL。反應條件為95℃ 15 s變性，55℃5 s退火，72℃15 s延伸，共40個循環。擴增結束后分析熔解曲線，采用雙標曲線法計算各基因的相對表達量，以對照1組各基因表達量作為對比標準。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以s表示，組間比較用t檢驗和單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組VO時間、D1、卵巢指數、子宮指數、子宮壁厚度、血清LH比較 見表1。

2.2 各組卵巢黃體出現個數 對照1組卵巢黃體出現1～2個/卵巢，實驗1、2組和對照2、3組卵巢黃體出現3～5個/卵巢。

2.3 下丘腦組織超微結構 電鏡下可見，青春前期組下丘腦弓狀核GnRH神經元核較大，呈圓形或橢圓形，通常1個核仁，游離核糖體、高爾基體和線粒體較少;胞質中致密芯分泌顆粒和清亮小泡很少。實驗組青春期GnRH神經元核較飽滿，高爾基體和線粒體增多;胞質中致密芯分泌顆粒和清亮小泡增多，細胞器形態無明顯異常。

表1 各組VO時間、D1、卵巢指數、子宮指數、子宮壁厚度、LH比較(n=10，s)

表1 各組VO時間、D1、卵巢指數、子宮指數、子宮壁厚度、LH比較(n=10，s)

注:與對照2、3組比較，aP＜0.05;與其他組比較，bP＜0.05;與對照2組、實驗1組比較，cP＜0.05

組別 VO時間(d) D1(d) 子宮指數(×10－3) 卵巢指數(×10－4) 子宮壁厚度(×10－2mm) LH(mU/mL)對照1組 — — 1.29±0.41b 2.67±0.61b 57.8±9.96b 5.46±0.48b對照2組 37.1±1.66 41.9±1.73 2.07±0.25 4.71±0.84 79.7±12.54 6.80±0.36對照3組 37.3±2.45 42.1±1.41 2.78±0.88c 5.51±0.70c 100.2±10.01c 7.79±0.29c實驗1組 33.2±1.87a 36.7±1.57a 2.08±0.39 4.57±0.81 81.3±11.33 6.81±0.22實驗2組 33.3±1.88a 36.9±1.25a 2.74±0.65c 5.81±0.78c 101.1±9.42c 7.80±0.32c

2.4 各組下丘腦中KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA表達比較 見表2。

表2 各組下丘腦中KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA表達比較(s)

表2 各組下丘腦中KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA、GnRH mRNA表達比較(s)

注:與其他組比較，aP＜0.05;與對照2組、實驗1組比較，bP＜0.05

組別 n KISS-1 mRNA GPR54 mRNA GnRH mRNA對照1組 10 0.95±0.41a 0.90±0.37a 1.04±0.67a對照2組 10 3.01±0.89 2.54±0.94 2.41±1.31對照3組 10 4.90±0.45b 4.40±0.92b 4.36±1.17b實驗1組 10 3.36±0.81 2.86±0.88 2.68±1.21實驗2組 10 5.09±1.55b 4.88±1.25b 4.21±1.97b

3 討論

CPP表現為正常青春期發育提前，在青春期發育過程中，下丘腦GnRH神經元興奮起重要作用，GnRH分泌旺盛是青春期發育的基礎［1］。神經元興奮性沖動傳遞，需要興奮性神經遞質和受體的協同作用。中樞神經系統的興奮性氨基酸遞質主要包括谷氨酸和天冬氨酸，NMA受體是主要的谷氨酸受體亞型，NMA是其重要的激動劑［2］。本研究采用皮下注射NMA方法建立CPP模型，與文獻報道［3］相同。本研究顯示，實驗組VO、D1較對照組提前，表明大鼠青春期提前啟動;各組卵巢指數、子宮指數、子宮壁厚度、卵巢黃體出現個數、LH及下丘腦GnRH mRNA表達均高于對照1組(與文獻［4］報道相同)，且上述指標對照3組高于對照2組、實驗2組高于實驗1組，對照3組和實驗2組、對照2組和實驗1組無統計學差異;說明實驗組大鼠的下丘腦—垂體—性腺軸逐步完全激活，較正常大鼠性發育提前，其進入青春期后的發育與正常青春期大鼠類似。GnRH主要由位于下丘腦弓狀核的GnRH神經元分泌，本研究發現，實驗組青春期弓狀核GnRH神經元代謝逐漸活躍，分泌旺盛，與正常青春期大鼠類似。因此，皮下注射NMA可提前激活雌性大鼠的下丘腦—垂體—性腺軸，良好地模擬CPP的病理生理過程，建立理想的實驗動物模型。

GPR54是一種新的孤兒G蛋白偶聯受體［5］，在胰腺和胎盤中表達最豐富，在下丘腦、垂體、邊緣系統、基底節中表達較豐富［5～7］。KISS-1基因是1996年在黑色素瘤細胞中發現的一種新型的腫瘤轉移抑制基因［8］，Kisspeptin是KISS-1基因編碼產生的多肽家族，其經蛋白水解產生一種含有54個氨基酸的生物活性肽Metastin，作為GPR54的天然配體［6］。Kisspeptin與GPR54結合可激活磷脂酶C，致細胞內磷脂酰肌醇、Ca2+增多，進一步激活細胞外調節蛋白激酶和P38細胞分裂素活化蛋白激酶途徑，進行信號傳導［7］。有研究表明，鼠類和人類的 KISS-1、GPR54基因突變均可影響正常青春期性發育和LH的脈沖式分泌，導致性腺功能低下或生育能力喪失［9］。Rhie等［10］對 CPP女童研究發現，其血清Kisspeptin明顯升高，且與LH峰值、LH峰值/基值、LH/FSH呈正相關，認為Kisspeptin可作為診斷CPP的臨床標志物。Shahab等［11］研究發現，在無生殖腺的雄性幼猴側腦室注射Kisspeptin能刺激LH分泌，出現性早熟表現，表明Kisspeptin能打破青春前期哺乳動物GnRH分泌的中樞性抑制狀態;并發現正常雌猴下丘腦KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA表達隨青春期發育逐漸增加。本研究結果與其報道相似，表明Kisspeptin-GPR54-GnRH神經元軸活化能全面激活青春期哺乳動物的神經內分泌生殖軸。本研究表明，Kisspeptin與GPR54結合可致GnRH神經元活化，代謝活躍，GnRH產生增多，并可能伴隨青春發育的全過程。

綜上所述，NMA可提前激活下丘腦—垂體—性腺軸，導致雌性大鼠CPP。隨著青春期發育，正常發育大鼠、CPP大鼠的下丘腦KISS-1 mRNA、GPR54 mRNA及GnRH mRNA表達逐漸升高，提示Kisspeptin-GPR54-GnRH神經元軸在CPP的發生、發展中起重要作用，可能成為CPP治療的新靶點。

［1］Terasawa E，Fernandez DL.Neurobiological mechanisms of the onset of puberty in primates［J］.Endocr Rev，2001，22(1):111-151.

［2］Moguilevsky JA，Wuttke W.Changes in the control of gonadotrophin secretion by neuro-transmitters during sexual development in rats［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2001，109(4):188-195.

［3］李海浪，潘鍵，鄭意楠.興奮性氨基酸受體激動劑誘導雌性大鼠青春期發生的實驗研究［J］.實用兒科臨床雜志，2003，18(12): 952-954.

［4］潘鍵，李海浪，鄭意楠.雌性大鼠真性性早熟發生模型的實驗研究［J］.中華內分泌代謝雜志，2004，20(1):84-85.

［5］Lee DK，Nguyen T，O'Neill GP，et al.Discovery of a receptor related to the galanin receptors［J］.FEBS Letters，1999，446(1): 103-107.

［6］Muir AI，Chamberlain L，Elshourbagy NA，et al.AXOR12，a novel human G protein-coupled receptor，activated by the peptide KiSS-1［J］.J Biol Chem，2001，276(31):28969-28975.

［7］Kotani M，Detheux M，Vandenbogaerde A，et al.The metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes kisspeptins，the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54［J］.J Biol Chem， 2001，276(37):34631-34636.

［8］Lee J H，Miele ME，Hicks DJ，et al.KiSS-1，a novel human malignant melanoma metastasis-suppressor gene［J］.J Natl Cancer Inst，1996，88(23):1731-1737.

［9］Colledge WH，d'Anglemont de Tassigny X.The role of kisspeptin signalling in the regulation of the GnRH-gonadotrophin ovarian axis in mice［J］.Ann Endocrinol，2010，71(3):198-200.

［10］Rhie YJ，Lee KH，Eun SH，et al.Serum kisspeptin levels in korean girls with central precocious puberty［J］.J Korean Med Sci，2011，26(7):927-931.

［11］Shahab M，Mastronardi C，Seminara SB，et al.Increased hypothalamic GPR54 signaling:a potential mechanism for initiation of puberty in primates［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(6): 2129-2134.