多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓微血管密度和血清β2-微球蛋白檢測(cè)的臨床意義

劉 健，歐陽清，王曉桃，莫東華，唐愛林

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林541001)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是B細(xì)胞來源的漿細(xì)胞惡性血液病腫瘤，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前還不能完全治愈。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MM的發(fā)生、發(fā)展依賴于新生的腫瘤血管網(wǎng)，血管新生與MM患者疾病進(jìn)程及預(yù)后密切相關(guān)［1，2］。反映血管新生最常用的一項(xiàng)指標(biāo)是微血管密度(MVD)。目前認(rèn)為β2-微球蛋白(β2-MG)水平是MM患者最重要的預(yù)后因素，是反映體內(nèi)瘤負(fù)荷的一種常用指標(biāo)［3］。本研究中我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MM患者治療前后骨髓MVD，并同時(shí)用膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測(cè)定MM患者血清β2-MG，探討MVD和β2-MG在MM發(fā)生、發(fā)展中的作用，及其與臨床病情和預(yù)后的關(guān)系，為新診斷MM患者預(yù)后的判斷及制定新的治療方案提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年9月～2011年12月在我院初診并治療的MM患者34例，其中男21例、女13例，年齡43～78歲、平均56歲。所有MM的診斷與分期均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)、X線骨盆或脊柱攝片、生化免疫檢查，診斷標(biāo)準(zhǔn)、臨床分期及療效判斷均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［4］。按疾病臨床分期(ISS)標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期6例，Ⅱ期8例，Ⅲ期20例。34例初診患者住院采用T-VAD或BDT、MP方案化療，4個(gè)療程后進(jìn)行療效評(píng)估判斷。其中緩解組26例，男17例、女9例，年齡43～78歲、平均54歲;未緩解8例，男4例、女4例，年齡47～76歲、平均59歲。另選外周血一系或兩系非特異性降低或升高患者的骨髓活檢標(biāo)本作為對(duì)照組，共30例，男16例、女14例，年齡21～52歲、平均40歲。均排除惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及結(jié)締組織病。骨髓涂片瑞氏染色及骨髓活檢蘇木精—姬姆莎—酸性品紅(HGF)染色證實(shí)為正常骨髓象，骨髓活檢取材前未應(yīng)用過糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒類藥物。

1.2 取材與處理 MM患者初診及4個(gè)療程后，分別行常規(guī)消毒髂后上棘局麻后行二步法骨髓抽吸—活檢取材，置骨髓活組織于－80℃丙酮液固定，用改良的GMA塑料包埋制成3～5 μm厚的骨髓組織病理切片。同時(shí)每例患者清晨空腹采靜脈血3 mL測(cè)定血清β2-MG。

1.3 免疫組化染色(SP二步法)及血清β2-MG檢測(cè)方法 免疫組化試劑購自福建邁新生物技術(shù)公司。采用CD31作為骨髓血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記抗原，一抗為兔抗人CD31單克隆抗體，血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色參照SP超敏試劑盒說明書進(jìn)行。血清β2-MG測(cè)定采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，使用日本日立公司生產(chǎn)的Roche Modular P800全自動(dòng)生化及配套試劑。

1.4 骨髓MVD計(jì)數(shù) 微血管判定和計(jì)數(shù)方法參照文獻(xiàn)［5］，對(duì)每張切片進(jìn)行骨髓MVD計(jì)數(shù):低倍鏡(100×)視野下選出血管最豐富的3個(gè)不相連區(qū)域(hot spot)，然后在高倍鏡下(400×)計(jì)數(shù)3個(gè)熱點(diǎn)(微血管密集區(qū)hot spot)的微血管數(shù)，取其平均值即為MVD。任何呈棕黃色陽性的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，且與鄰近血管和骨小梁清楚分開者為1個(gè)能夠計(jì)數(shù)的血管，不以是否有管腔或管腔中是否有紅細(xì)胞為判斷標(biāo)準(zhǔn)，排除骨小梁內(nèi)或與骨小梁相連的血管。巨核細(xì)胞也被染色，但從形態(tài)上可與內(nèi)皮細(xì)胞鑒別，不作計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用s表示，組間比較采用成組設(shè)計(jì)資料兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，多樣本的比較用方差分析，一般相關(guān)性用簡單相關(guān)分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MVD、β2-MG水平 見表1。

表1 MM患者實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組骨髓MVD及血清β2-MG水平比較(s)

表1 MM患者實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組骨髓MVD及血清β2-MG水平比較(s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01

組別 n MVD(個(gè)/HP) β2-MG(mg/L)實(shí)驗(yàn)組 34 33.07±11.24* 8.75±3.70*對(duì)照組30 10.56±4.06 1.96±0.70

2.2 骨髓MVD與ISS之間的關(guān)系 事后采用LSD進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)ISS分期為Ⅲ期MM患者［20例，年齡(39.73±8.33)歲］的骨髓MVD明顯高于Ⅰ期［6例，(18.92±6.09)歲］和Ⅱ期患者［8例，(27.11±6.10)歲］，F(xiàn)=20.42、P＜0.01，且Ⅰ期、Ⅱ期之間骨髓MVD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 治療前后MM患者骨髓MVD、血清β2-MG水平的變化 見表2。

表2 治療前后MM患者骨髓MVD及血清β2-MG水平比較(s)

表2 治療前后MM患者骨髓MVD及血清β2-MG水平比較(s)

注:與治療前緩解組比較，*P＜0.01

組別 n MVD(個(gè)/HP)β2-MG(mg/L)治療前 治療后緩解組 26 30.77±8.36 17.99±4.11* 7.94±2.86 2.79±0.94治療前 治療后*未緩解組 8 34.91±9.41 32.66±7.18 10.14±5.34 9.79±4.77

2.4 實(shí)驗(yàn)組骨髓MVD與血清β2-MG水平和ISS的相關(guān)分析 實(shí)驗(yàn)組骨髓MVD與血清β2-MG水平明顯相關(guān)(r=0.607、P＜0.01)，骨髓MVD與ISS臨床分期也明顯相關(guān)(r=0.643、P＜0.01)。

3 討論

骨髓血管新生在各種惡性血液系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視，研究證實(shí)多數(shù)惡性血液系統(tǒng)疾病骨髓MVD增加，其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的作用以MM研究最早［2，5，6］。本研究發(fā)現(xiàn)初診未治MM患者組較正常對(duì)照組骨髓MVD明顯增高，而且治療有效組較治療前MVD明顯下降，無效組則下降不明顯。MM患者骨髓微血管較正常對(duì)照骨髓數(shù)量多，微血管部分呈逗點(diǎn)狀、小管狀或條索狀，可見許多細(xì)小分支，血管形態(tài)幼稚，無明顯的血管管腔，而正常骨髓組織的微血管管腔大，分支少見，形態(tài)較成熟。化療后有效組部分見血管管腔稍增大，分支少見，接近對(duì)照組骨髓腔情況，部分患者改變不大;而無效組則仍見病理性血管新生明顯。說明血管新生在MM的發(fā)病機(jī)理中有重要作用。有研究報(bào)告，血管內(nèi)皮生長因子(vEGF)及其受體在MM患者明顯增高，而vEGF及其受體是目前已知作用最強(qiáng)、特異性最高的血管新生正性調(diào)控因子，在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮核心作用。vEGF通過自分泌與旁分泌作用途徑，刺激瘤細(xì)胞的增殖與生存，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及微血管生成，從而導(dǎo)致骨髓MVD增高［8］。因而，MM患者M(jìn)VD明顯高于對(duì)照組。治療有效組治療后MVD減少的原因考慮主要與化療藥對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的直接和間接細(xì)胞毒作用有關(guān):一方面化療藥直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡增加;另一方面化療藥通過殺傷骨髓瘤細(xì)胞，減少促血管形成的細(xì)胞因子分泌，間接抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。因此，治療有效組經(jīng)治療后骨髓MVD較治療前明顯下降，這也說明骨髓MVD能反映患者近期療效。本研究還發(fā)現(xiàn)，在接受治療后，無論是無效還是緩解，骨髓中MVD高于正常對(duì)照組，這可能是殘存的骨髓瘤細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的持續(xù)刺激導(dǎo)致血管生成增加，病理性血管新生對(duì)現(xiàn)有的治療方法不夠敏感，可能是目前MM不如其他一些惡性血液系統(tǒng)疾病療效好的原因之一。

MM患者且活動(dòng)期MM患者骨髓MVD明顯高于非活動(dòng)期患者［1，6］。腫瘤負(fù)荷高的MM患者明顯高于腫瘤負(fù)荷低的患者。目前在MM患者中反映體內(nèi)瘤負(fù)荷的水平通常用β2-MG和ISS臨床分期。目前國內(nèi)外研究報(bào)道多變量相關(guān)分析表明，β2-MG是所有參數(shù)中與腫瘤負(fù)荷最相關(guān)的參數(shù)，直接反映了MM患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，與患者生存期相關(guān)。而ISS臨床分期最直接的依據(jù)就是血清β2-MG和ALB水平。本研究發(fā)現(xiàn)初診未治的MM患者骨髓MVD與血清β2-MG水平明顯相關(guān)，Ⅲ期患者骨髓MVD水平最高，Ⅱ期次之，Ⅰ期最低，三者之間差異具有顯著性。這說明骨髓MVD可反映腫瘤負(fù)荷、分期和預(yù)后。研究表明MM腫瘤組織內(nèi)新生的微血管主要分布在腫瘤生長活躍的邊緣，也就是瘤負(fù)荷最高的區(qū)域。MM患者瘤細(xì)胞呈灶性分布，我們采用骨髓病理切片直接量化反映腫瘤的血管生成程度，它反映了腫瘤微血管形成的強(qiáng)度與腫瘤的侵襲性，且與腫瘤負(fù)荷相關(guān)［11］。這與我們研究報(bào)道的骨髓MVD與ISS臨床分期及β2-MG呈正相關(guān)一致，因此，骨髓MVD可間接反映MM患者體內(nèi)瘤負(fù)荷的水平。

綜上所述，骨髓MVD可作為MM患者臨床分期、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷的輔助指標(biāo)。通過證實(shí)MM患者骨髓中存在血管新生現(xiàn)象，支持了關(guān)于血管新生可能是MM發(fā)病機(jī)制之一的假說［5］，為應(yīng)用血管生成抑制劑這一新的治療策略治療惡性血液病提供了理論依據(jù)。

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