納米三氧化二砷磁性脂質體的熱化療作用對卵巢癌細胞nm23H1及c-myc的影響*

邢寶玲，張東生，王 麗，林 梅，余慧萍

(1.東南大學醫學院病理與病理生理學系，南京210009;2.常州市婦幼保健醫院，江蘇 常州213003)

磁性微載體是一種獨特的靶向藥物運載系統，包括納米脂質體、納米球和納米囊等，目前此類藥物磁性載體已可達納米水平。磁性粒子不僅可以被用作藥物載體，還可在交變磁場下發揮其居里溫度的特性升溫恒溫，從而對腫瘤進行熱療及化療。近幾十年來，砒霜(三氧化二砷，As2O3)治療白血病取得了良好的臨床效果，對實體腫瘤的治療研究也顯示出良好的應用前景。本研究小組已成功制備了在交變磁場下控溫恒溫的As2O3磁性納米脂質體［1］，其熱化療雙重作用可強烈抑制人卵巢癌HO－8910細胞的生長并誘導凋亡［2］。本文通過 nm23H1和c-myc表達的研究從分子水平進一步揭示As2O3磁性納米脂質體熱化療治療卵巢癌的機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

空白脂質體、As2O3溶液、納米As2O3脂質體以及以 Mn0.4Zn0.6Fe2O4為載體的 NML 和 NMLA 由本實驗室自行制備［1］;人漿液性卵巢癌HO－8910細胞株，中國科學院上海細胞研究所;β-actin、nm23H1、c-myc上下游引物，申能博彩公司合成;RT-PCR試劑盒，Takara公司;能譜儀，EDAX，美國;基因擴增儀，基因公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

HO－8910細胞接種于含有10%小牛血清的RPMI1640培養液中，在37℃、飽和濕度、體積分數為5%CO2的培養箱中培養，實驗時取對數生長期細胞。

1.2.2 工作液的制備

以含10%小牛血清的RPMI1640培養基將前述5種制劑分別配成工作液，使 As2O3的濃度為6 μmol·L－1，磁性材料的濃度為 15 mg·mL－1，對照組選用含10%小牛血清的RPMI1640培養液。

1.2.3 細胞處理、形態學觀察及能譜分析

制備濃度為3×105mL－1的細胞懸液，以每瓶4 mL種于6個培養瓶中，培養48 h后，分別加入以上5種工作液及培養液，并將NMLA熱療組和NML熱療組細胞置于200 kHz、4 kW的AMF中加熱40 min，繼續培養48 h后取出，收集細胞。制備超薄切片。

1.2.4 RT-PCR 分析 nm23H1、c-myc 的 mRNA表達

提取并純化總RNA。RT反應條件:42℃ 60 min，99 ℃ 5 min，0 ℃ 5 min.PCR 引物:nm23H1 F 5'GTGAAAAGCAATGTGGT 3'，R 5'TTGCCATGGTCTGGGAG 3'，267 bp;c-myc F 5'AAGTCCTGCGCCTCGCAA 3'，R 5'GCTGTGGCCTCCAGCAGA 3'，248 bp;β-actin F 5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3'，R 5'TTGCCATGGTCTGGGAG 3'，513 bp。

1.3 統計學方法

用SPSS11.5統計軟件進行分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

透射電子顯微鏡下觀察，As2O3化療和熱療后，均可見凋亡的HO8910細胞，染色質濃聚深染，邊集于核膜，形成致密的環狀或半月形結構，部分線粒體腫脹空化，細胞質膜有內折及泡狀外凸。在納米磁性脂質體組和磁性納米As2O3脂質體熱療組細胞漿中明顯可見散在或片狀聚集的電子密度高的物質(見圖1)，掃描電子顯微鏡下，任選一個納米As2O3磁性脂質體處理的細胞，能譜分析發現含有錳、鋅、鐵和砷等組分(見圖2)。

圖1 As2O3納米磁性脂質體熱療組:HO8910細胞胞漿內可見顆粒狀、片塊狀電子密度高的物質聚集，細胞核內異染色質濃染，邊集于核膜

圖2 納米As2O3磁性脂質體熱療處理細胞48 h的切片能譜圖(P元素為PBS緩沖液及磷脂中含有)

用Total Lab分析軟件對PCR電泳條帶進行掃描分析，目的片段和β-actin的比值作為實驗數據，用 SPSS11.5統計軟件進行單因素方差分析，nm23H1mRNA在HO8910細胞(培養液組，空白脂質體組)中有表達，As2O3溶液、As2O3脂質體及As2O3磁性脂質體可使其表達升高(P＜0.05)，磁性脂質體單純熱療不改變其表達量(P＞0.05)(見圖3(a))。c-mycmRNA在HO8910細胞中有表達，As2O3溶液、As2O3脂質體和磁性脂質體單純熱療均使其表達下降(P＜0.05)，As2O3磁性脂質體的熱療及化療作用對其表達量的下調更為明顯(P＜0.05)(見圖3(b))。

圖3 1納米As2O3磁性脂質體熱療組，2納米磁性脂質體熱療組，3納米As2O3脂質體組，4As2O3溶液組，5空白脂質體組，6培養液組，N陰性對照組(cDNA)

3 討論

納米脂質體是一種定向藥物載體，NMLA將Mn0.4Zn0.6Fe2O4磁感應粒子與 As2O3包裹于脂質體內，利用納米粒子載藥量高、細胞親和力強的特點，在高頻AMF中將熱療和化療的作用協同放大，對人漿液性卵巢癌HO－8910細胞具有明顯的生長抑制和促凋亡作用。

在治療惡性腫瘤方面，As2O3誘導凋亡及對抗腫瘤轉移相關基因的研究進行得較為廣泛而且深入［3－4］，而對于熱療治療腫瘤的機制研究較少，但也有文獻認為熱療也可誘導凋亡、對抗轉移，還可以逆轉腫瘤細胞耐藥［5－6］。熱療與化療作用不僅可以相加，而且可以產生協同放大的效應，同時或化療以后進行熱療，可以對化療制劑發揮增敏作用［7］。

nm23H1基因對腫瘤轉移有抑制作用［8］，在正常卵巢和卵巢良性腫瘤中均有nm23H1表達，但卵巢癌中的nm23表達率明顯高于正常卵巢組織、良性和交界性腫瘤，提示nm23H1表達與卵巢癌發生有關。淋巴結陰性的腫瘤nm23H1表達水平顯著高于淋巴結陽性的腫瘤，說明nm23H1基因是在卵巢癌發生早期被激活，對卵巢癌的淋巴結轉移起抑制作用。黃守國［9］研究As2O3對黏液性卵巢癌3AO的作用，體外實驗的結果是，As2O3誘導3AO細胞表面Fas基因的過量表達導致凋亡，誘導nm23基因的上調，抑制惡性卵巢腫瘤細胞的侵襲轉移能力。本實驗顯示，nm23H1在卵巢癌細胞HO8910中有明顯的表達，As2O3上調nm23H1的表達，磁性脂質體單純熱療對它的表達無明顯影響。本實驗的熱療與水浴、微波等加熱方式不同，是納米磁性粒子進入細胞介導的反應，更為直接快速，對癌細胞的殺傷力度更強，而熱療本身是否能夠抑制腫瘤轉移及其途徑，還需要進一步研究。

c-myc基因與惡性腫瘤的發生發展密切相關，有學者［10］研究了Myc的相關蛋白Max和Mad，發現在正常細胞和癌細胞中c-myc都表達，其正常表達是細胞完成周期過程所必須的，但正常細胞中高表達Mad，而癌細胞中高表達Max，c-myc的表達產物與Mad的表達產物競爭結合Max蛋白，癌細胞中Myc-Max蛋白二聚體促進了人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因的轉錄，正常細胞中hTERT的低表達與Myc-Max蛋白二聚體轉錄活性的丟失有關。Shen等［11］實驗證實，經 As2O3誘導后，細胞的 Bcl－2和c-myc基因表達均下調，一方面促進細胞凋亡的發生，另一方面通過下調hTERT的表達來下調端粒酶活性。Trieb［12］發現高溫(42.5 ℃，90 min)可逆性下調骨肉瘤細胞的端粒酶活性，抑制骨肉瘤細胞的增生。但熱療與c-myc的關系不清楚。

33% ～37%的卵巢上皮性癌有c-myc基因的擴增或過表達，c-myc過表達更常見于漿液性腺癌，與腫瘤分期有關，提示在腫瘤進展期中起作用。HO8910細胞來自于漿液性卵巢癌患者的腹水中，經As2O3或熱療的作用后，它的表達量均下降，As2O3和熱療的聯合處理使其表達進一步降低，推測As2O3和熱療都可通過降低c-myc基因的表達來誘導HO8910細胞凋亡，二者聯合可以增強這一途徑誘導凋亡，但本實驗中是否c-myc的下降通過抑制hTERT基因轉錄最終下調端粒酶的活性來誘導凋亡，還需要進一步的實驗加以證實。

研究表明nm23基因與c-myc基因在許多腫瘤中有陽性表達，c-myc的陽性率隨著卵巢癌浸潤程度及淋巴結轉移而增高，說明c-myc蛋白過度表達對癌細胞的浸潤轉移起促進作用。nm23H1的過度表達可促使基底膜的形成，抑制腫瘤的生長和轉移，還能部分抑制腫瘤形成［8］。c-myc與nm23之間雖無明確的內在相關性，但對二者的再深入研究，對于進一步了解腫瘤細胞增殖、分化和轉移的機制，抗轉移藥物的篩選將產生不可估量的作用。本研究通過新納米藥物劑型－NMLA對HO8910細胞的作用，表明了As2O3和熱療對漿液性卵巢癌的治療作用與cmyc和nm23 H1相關，NMLA的熱化療作用還可協同增強下調c-myc的表達。

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