廣州一號桉樹高效組培再生體系的建立1)

歐陽樂軍 沙月娥 黃真池 曾富華

(湛江師范學院，湛江，524048)

桉樹是世界三大速生樹種之一，共有1 039 個種、亞種和變種。據統計，全世界桉樹人工林面積超過2 000 萬hm2，是世界公認的三大人工林樹種之一［1］。中國引種桉樹已有120 a 歷史，在17 個省(區)種植，每年新營造桉樹林達33 萬hm2，2011年，我國桉樹人工林面積已達到368 萬hm2，占全國人工林面積的6%以上，年生產木材近4 000 萬m3，占國內自主生產紙漿材的50%以上，是我國重要的經濟林樹種［2］。廣州一號桉是尾葉桉(E. urophylla)與細葉桉(E. tereticornis)的雜交種，具有速生豐產、抗逆性強的雜種優勢，但由于不定芽分化率低，種苗快繁困難，生產上尚未能大面積推廣，關于廣州一號桉組織培養再生體系的研究也未見報道。

本試驗在前期工作的基礎上［3］，利用噻唑基脲類新型分裂素(N－phenyl－N'－［6－(2－chlorobenzothiazol)－yl］urea，PBU)誘導廣州一號桉高分化潛能的愈傷組織形成和不定芽分化增殖，使不定芽分化率達到90%，生根率為100%，并通過移栽方法優化，使組培苗移栽成活率達到95%，建立了廣州一號桉高效組織培養再生體系。為生產上廣州一號桉大規模商品化育苗提供一定的參考，也為廣州一號桉遺傳轉化體系的建立奠定了基礎。

1 材料與方法

供試材料為湛江市林業科學研究所提供的廣州一號桉無菌苗，挑取粗壯的幼苗，將其嫩莖切成0.5 ～0.8 cm 長的不帶芽點的莖段作為外植體。

PBU 由廣東高校邊緣熱帶特色植物工程技術開發中心李再峰等［4］合成，先將PBU 溶于少量二甲基甲酰胺，再加水定容至質量濃度為100 mg·L－1母液備用;2，4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)、吲哚－3－丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、6－芐基腺嘌呤(6－BA)、亞精胺(Spd)、腐胺(Put)、維生素C(Vc)、N－苯基－N'－1，2，3－噻二唑－5－脲(TDZ)均購置于生工生物工程(上海)有限公司，基本培養基采用MS 培養基，培養條件為溫度(25±2)℃，光照強度約32.5 μmol·m－2·s－1，光照時間12 h·d－1。

愈傷組織誘導:將外植體接種于愈傷組織誘導培 養基(MS+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc，添加不同質量濃度的TDZ 與2，4－D 組合以及PBU 與IAA 組合，pH 值為5.8 ～6.0)上，于(25±2)℃下暗培養14 d，再光暗交替培養7 d 后計算愈傷組織形成情況及誘導率。

不定芽的分化:將外植體接種于愈傷組織誘導培 養基(MS+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc+2 mg·L－1PBU+0.06 mg·L－1IAA，pH值為5.8 ～6.0)上，經暗培養14 d、光暗交替培養7 d 后，再將外植體接種于不定芽分化培養基(1/2MS+500 μmol·L－1Put+100 μmol·L－1Spd+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc，添加不同質量濃度梯度的6－BA 和NAA 組合、6－BA 和IAA 組合，pH 值為5.8 ～6.0)上，40 d 后統計愈傷組織生長情況和不定芽誘導率。同時，分別用2 mg·L－1PBU 和0.06 mg·L－1IAA 組合、1.0 mg·L－12，4－D 與0.05 mg·L－1TDZ 組合(對照)誘導的兩種愈傷組織作不定芽誘導率的比較，統計2 種不同激素組合誘導的愈傷組織在相同的不定芽誘導條件下(激素組合為1 mg·L－16－BA 和0.1 mg·L－1NAA)，不定芽誘導情況的差異。

不定芽的增殖與伸長:將高約0.5 cm 且長勢較好的芽叢切割成單株，保留部分愈傷組織基部，轉移到不定芽伸長培養基(1/2MS+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc，添加不同質量濃度梯度的PBU 與NAA 組合，pH 值為5.8 ～6.0)上培養，20 d后統計不定芽伸長情況。

不定芽的生根:將高為3 ～4 cm 的無菌苗轉入生根培養基(1/2MS+30 g·L－1蔗糖+7 g·L－1瓊脂+100 mg·L－1Vc，分別添加不同質量濃度梯度的IBA、IAA 以及NAA，pH 值為5.8 ～6.0)中，培養20 d 后統計生根情況及生根率(即生根苗數占總苗數的百分率)。

煉苗與移栽:將生根良好的生根苗分成3 組，分別從恒溫光照培養箱移至室外自然環境中分別煉苗10、15、20 d。挖取黃心土(山地紅壤)、腐殖質土，分別以質量m(黃心土)∶m(腐殖質土)=1 ∶1、m(黃心土)∶m(腐殖質土)= 2 ∶1、m(黃心土)∶m(腐殖質土)=3 ∶1 3 種基質裝于花盆當中，澆透水，將煉苗后的生根苗移栽至上述3 種基質中，20 d 后統計移栽成活率。

愈傷組織誘導及不定芽分化的每個試驗處理均設置5 個重復的培養皿，每個培養皿接種20 個外植體，外植體愈傷組織以切口基部能觀察到球狀突起，即生長出直徑大于2 mm 的愈傷組織計數，愈傷組織誘導率為生長愈傷組織外植體占接種外植體數的百分比。不定芽分化率以愈傷組織表面生長出大于4 mm 芽點的愈傷組織數占接種愈傷組織數的百分比［5］。不定芽伸長、生根及移栽的每個處理均設置5 個重復，每個重復5 個單株。數據利用SAS 分析軟件進行處理，文中百分率數據分析時經過正弦平方根轉換。

2 結果與分析

2.1 不同植物生長調節劑組合對愈傷組織形成的影響

外植體在愈傷組織誘導培養基上培養5 ～10 d，切口兩端陸續開始產生愈傷組織，外植體呈啞鈴狀，以后逐漸從兩端延伸形成膨大的愈傷組織。在光下培養1 周后，愈傷組織逐漸變為綠色，產生芽點(圖1A)。

由表1可知，2，4－D 與TDZ 組合、PBU 與IAA組合，都能誘導愈傷組織形成，同一組合的不同質量濃度處理間愈傷組織誘導率差異達到極顯著水平。PBU 與IAA 組合處理下的愈傷組織誘導率比2，4－D 與TDZ 組合高，愈傷組織形成快，結構較致密，在后續不定芽誘導中分化能力更好。當PBU 質量濃度為2 mg·L－1，IAA 質量濃度為0.06 mg·L－1時，5 d 后愈傷組織誘導率可達到100%。

表1 不同植物生長調節劑組合對愈傷組織誘導的影響

2.2 不同植物生長調節劑組合對不定芽分化的影響

由表2可知，同一植物生長調節劑組合的不同質量濃度處理間不定芽誘導率差異達到極顯著水平。在6－BA 和IAA 的組合中，誘芽率較低，最高誘導率僅為46%，且不定芽生長情況一般。6－BA 和NAA 的組合中，當6－BA、NAA 的質量濃度分別為1.0、0.10 mg·L－1時，誘芽率達到最大，為90%，生長狀況好，30 d 后每塊愈傷組織能產生約20 個小芽(圖1B、C)。

表2 不同植物生長調節劑組合對不定芽分化的影響

為了進一步探究用PBU 誘導的愈傷組織對后續誘芽率的影響，分別用2 mg·L－1PBU 和0.06 mg·L－1IAA 組合、1. 0 mg·L－12，4－D 與0. 05 mg·L－1TDZ 組合(作對照)誘導的2 種愈傷組織作誘芽率的比較，結果表明，在相同的不定芽誘導條件下，經PBU 誘導的愈傷組織平均誘芽率達到90.0%，而對照處理的誘芽率則只有49.6%，經t 檢驗，差異達到極顯著水平。

2.3 不同質量濃度NAA 和PBU 組合對不定芽伸長的影響

本試驗設計的所有植物生長調節劑組合誘導芽伸長高度的差異很大，從0.5 ～5 cm 不等(表3)。在低質量濃度的NAA 誘導下，不定芽增殖較多，明顯影響到芽伸長的效率;當NAA 質量濃度為0.05 mg·L－1，PBU 質量濃度為0.2 mg·L－1時，不定芽有3 ～5 cm 的明顯伸長，葉片綠色，芽苗生長情況較好(圖1D)。

2.4 不同質量濃度的植物生長素對生根的影響

將3 cm 左右高的叢生芽切成單株后轉入生根培養基，6 d 后在莖基部開始膨大，并有白色根點突起，9 ～15 d 后陸續長根，根由莖直接發出，無愈傷組織形成(圖1E)。

如表4可見，不同質量濃度的3 種植物生長素誘導生根率差異較大，經方差分析達到極顯著水平。當IBA 質量濃度為0.2 mg·L－1時，生根率最高可達100%，且生根時間短，根粗壯，根系發達;其次是IAA，生根誘導率最高也可達80%以上。而3 種質量濃度的NAA 誘導生根的效果均不是很好，誘導率均沒有超過40%。

表3 不同質量濃度的NAA 和PBU 組合對不定芽伸長的影響

表4 不同質量濃度的生長調節劑對生根的影響

2.5 煉苗時間及移栽基質對生根苗移栽成活率的影響

從表5及表6中可知，不同煉苗時間以及移栽基質對廣州一號桉生根苗移栽成活率影響較大。煉苗天數為15 d時成活最高，為95% 。移栽基質中m(黃心土)∶m(腐殖質土)= 1 ∶1 時，移栽后成活率最高，為95%，且長勢也最好(圖1F)。

表5 不同煉苗時間及移栽基質對移栽成活率的影響

表6 不同移栽基質對移栽成活率的影響

圖1 廣州一號桉樹再生過程

3 結論與討論

桉樹是多年生木本植物，其細胞返幼狀態差，難以脫分化，也難于分化成芽，外植體也極易褐化，因此，在組織培養中誘導愈傷組織形成和分化均有較大難度，特別是廣州一號桉是公認的一種不定化分化困難、快繁系數低、組培種苗生產成本高的桉樹雜交樹種。本實驗室利用PBU 和其他植物生長調節劑組合來誘導尾葉桉、尾巨桉、粗皮桉等桉樹樹種的愈傷組織，結果表明，PBU 能極大地提高愈傷組織誘導率，且活力更好，更有利于后續培養中不定芽的分化［6－8］。在本研究中，PBU 比6－BA 更利于尾巨桉愈傷組織誘導，可能是因為PBU 是在N－取代苯基－N－(6－苯并噻唑基)脲類化合物的基礎上，以2－硝基氯苯取代苯胺為原料，合成的脲類化合物，具有促進細胞分裂的作用，再加上IAA 的協同作用，誘導率明顯升高，使愈傷組織誘導率達到100%。特別是愈傷組織活力較好，分化潛力強，在后續的不定芽誘導中，不定芽誘導率高達90%，比未經PBU 誘導形成的愈傷組織不定芽誘導率高出近40%，差異達到極顯著水平，說明PBU 誘導形成的愈傷組織在后續培養中更有利于不定芽的分化。

在誘導不定芽的分化時，有部分學者采用KT誘導不定芽分化，因KT 作為一種具有很強的分裂素活性，能力較6－BA 強［9］，大部分學者都采用6－BA 和NAA 2 種激素進行配比［10－11］，結果證明不同質量濃度的6－BA 對桉樹不定芽的誘導影響很大，本研究結果也表明，6－BA 1.0 mg·L－1與NAA 0.06 mg·L－1組合誘導廣州一號桉不定芽形成的比率可達到90%，初步分析認為，促進細胞分裂能力相對較溫和的6－BA，能改善細胞內源生長素和細胞分裂素的比例，調節細胞生理生化狀態，有利于促進芽的分化，抑制根的分化。而KT 促進細胞分裂能力過強，不適于芽分化前期的愈傷生長，容易造成褐化。

在廣州一號桉組培苗培育過程中，長時間的高濕度生長環境影響了組培苗葉片的形態結構，如角質層變薄、氣孔調節失靈，加之組培苗的營養主要從培養基中獲得，光合作用效率低下，從而導致組培生根苗在移栽后，散失的水分多于吸收的水分，對外界環境的變化所做出的反應也相應較大，移栽成活變得更加因難。本試驗中通過對煉苗時間及移栽基質的優化，使移栽成活率高達95%。本研究發現，煉苗時間太短，組培苗難以適應外界環境;時間太長培養基易染菌，加之培養基消耗時間過長，營養不足，影響組培苗的生長，煉苗時間以15 d 為宜，多數組培苗植株葉片舒展，呈墨綠色，莖木質化程度好，根系發育正常，移栽成活率大為提高。同時，在移栽的腐殖質土中添加一定比例的黃心土，黃心土可以使組培苗染菌的機率大大降低，而腐殖質土則可使移栽基質疏松透氣且富含豐富的有機質，提高移栽成活率，促進幼苗的快速生長。

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