鵝掌楸屬樹種近交衰退分析1)

姚俊修 李火根 邊黎明 施季森

(林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室(南京林業大學)，南京，210037)

交配系統是影響群體遺傳結構的主要因素［1］。異交是維持種內遺傳變異的一個重要機制［2-3］;而近交則降低種內遺傳變異，導致后代群體的遺傳組成趨于純合、遺傳性狀穩定，并使隱性基因得以表現而被淘汰［4-7］。近交導致子代適合度下降，如種子數量和質量下降、個體的生長發育不良等，呈現不同程度的近交衰退［8-10］。近交衰退是植物交配系統進化的主要選擇壓力之一，植物或者適應近交，或者通過形成避免發生近交機制來防止近交衰退［3］。

木蘭科(Magnoliaceae)鵝掌楸屬(Liriodendron)樹種為珍貴用材與園林觀賞兼用樹種，現僅存2 個種，即鵝掌楸(L. chinense Sarg.)和北美鵝掌楸(L.tulipifera Linn.)，前者主要分布于我國長江以南及越南北部，后者分布于美國東部和加拿大東南部。由于自然與人為原因，導致鵝掌楸天然種群個體數目日益減少，種群間成島狀星散分布，彼此隔離，已列為我國二級瀕危保護樹種［11-12］。與大多數林木相似，自然情況下，鵝掌楸屬樹種以異交為主。近交物種遺傳組成高度雜合，但同時也蘊含了較高的遺傳負荷。隨著鵝掌楸種群數目逐漸減少，種群內近交機率大大增加，勢必增加有害基因純合的概率，從而使鵝掌楸發生近交衰退，加劇其瀕危程度。為分析鵝掌楸近交衰退表現，筆者擬利用交配設計，采用人工雜交獲得不同交配類型組合子代(包括種間雜交、種內雜交、回交及自交)，通過比較不同交配類型子代的種子飽滿度、出苗率、苗期生長量，以及SSR 純合子比率等信息，從表型與基因型兩方面分析鵝掌楸近交衰退狀況，期望為鵝掌楸物種保護、雜交育種及種子園管理等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鵝掌楸交配親本來自南京林業大學下蜀實習林場，其中，4 株鵝掌楸(編號:LS，WYS，FY 和SZ)、4株北美鵝掌楸(編號:MSL，BM，LYS 和NK)雜交親本來自1993年定植的鵝掌楸種源試驗林，該試驗林具體情況可參考文獻［13］。另一交配親本雜交鵝掌楸(F1)選自1978年定植于該林場的雜種子代測定林，其母本為鵝掌楸，來自江西廬山;父本為定植于南京明孝陵的1 株北美鵝掌楸，20 世紀30年代引自美國。2007年5月，分別對這9 個雜交親本用毛竹搭架，開展人工雜交試驗，共26 個交配組合，其中，回交組合15 個，F1為母本有7 個組合:F1×LS、F1×MSL、F1×BM、F1×WYS、F1×LYS、F1×NK、F1×FY;F1為父本有8 個組合:LS×F1、MSL×F1、BM×F1、WYS×F1、LYS×F1、NK×F1、FY×F1、SZ×F1;種間交配組合4 個:LS×NK、LYS×LS、WYS×BM、BM×FY;種內交配組合4 個:LYS×MSL、BM×MSL、BM×NK、LYS×NK;自交組合3 個:SY×SY、MSL×MSL、LYS×LYS。

2007年10月采集上述交配組合種子，2008年3月播種于南京橋林林業科技有限公司苗圃，同年9月采集上述各組合子代幼苗葉片，每家系隨機采取30 個個體(不足30 的全部取樣)，每個體采集新鮮葉片2 ～4 片，放入冰箱中-70 ℃保存備用。2009年3月，對各交配組合子代在同一苗圃進行苗期試驗，2009年12月，獲得15 個回交組合(7 個正交組合，8個反交組合)，其中，一個自交組合MSL 獲得子代數目較少，僅有8 株。共采集各類交配組合子代樣本610 株。

為了檢測近交組合子代的飽滿度與出苗率，2008年5月開展第2 批雜交。選取2 株鵝掌楸(LS、WYS)及2 株北美鵝掌楸(MSL、BM)作母本，以LS、FY、SZ、F1、LYS、BM、WYS、MSL、NK 為父本，開展如表1的交配設計，于同年10月采集上述交配設計種子，12月在國家林業局南方林木種子檢驗中心測定種子飽滿度，2009年3月在南京橋林林業科技有限公司苗圃進行場圃發芽率測定。

表1 鵝掌楸不同交配組合設計

1.2 試驗方法

1.2.1 種子飽滿度及出苗率測定

對表1中27 個不同交配組合子代種子應用X射線攝影檢驗技術進行飽滿度檢驗，每組合每處理含100 粒種子，4 次重復，根據種子有無胚的影像進行飽滿度的判斷，統計飽滿種子數。種子出苗率往往以發芽勢為判斷指標，指種子發芽初期在規定時間內能正常發芽的種子粒數占供檢種子粒數的比例［14］。利用上述所得種子同時在相同立地條件下進行場圃出苗率測定。

1.2.2 苗期生長量測定

2009年12月，測量不同交配組合子代各單株的苗高(H)、地徑(D)，苗高和地徑均精確到0.01 cm，標準差與變異系數計算公式如下:①標準差(S)=式中:xi指第i 個個體的觀察值，指樣本平均值，n指樣本數;②變異系數c=(s/)×100%。

1.2.3 近交衰退估算

種子飽滿度、出苗率、苗期生長量3 個性狀的近交衰退估算采用公式δ=1-Ws/Wo［15］，式中，Ws、Wo分別表示近交子代與異交子代的適合度。適合度有相對適合度與絕對適合度2 種，相對適合度是指某群體相對于特定基因型群體對子代的貢獻率，通常以絕對適合度最高的基因型為參照［16］。

1.2.4 純合子比率、基因雜合度及固定指數分析

利用12 對實驗室自行開發的SSR 引物［17］對4株鵝掌楸及4 株北美鵝掌楸親本基因雜合度及不同交配組合類型(種間雜交、種內雜交、回交、自交)子代進行PCR 檢測，統計每一親本及不同交配組合子代的純合子數量，計算純合子比率。其中雜合子比率(觀測雜合度Ho)與純合子比率之和為1。

固定指數F 是衡量配子間相關系數的指標，估算公式為F=1-H0/He［18］，式中Ho指觀測雜合度，是實際觀察到的雜合基因型個體所占的比率;He指期望雜合度，指隨機交配情形下雜合子的期望頻率。

1.2.5 統計分析

方差分析采用統計軟件SAS6.12。

2 結果與分析

2.1 鵝掌楸不同交配組合/類型子代的飽滿度及出苗率

對鵝掌楸不同交配組合飽滿度及出苗率研究發現:不同回交組合種子飽滿度變異較大，以F1×MSL最高，WYS×F1最低，二者相差13%。而相同親本的正反交組合飽滿度差異也較大，其中F1×WYS 與WYS×F1相差最大，為8.5%。回交中正交(F1為母本)組合平均為15.75%，反交組合平均為13.4%。可見，F1做母本種子飽滿度比F1做父本要大，平均高2. 35% 。而4 個自交組合種子飽滿度平均為3.88%。對出苗率分析發現:回交組合中MSL×F1出苗率最高，為10%，WYS×F1與F1×BM 出苗率均最低，為1.5%，二者相差8.5%。而相同親本的正反交組合出苗率差異也較大，F1×WYS 與WYS×F1相差最大，為2.75%;正反交組合種子出苗率變異不大，正交組合平均為4.44%，反交組合平均為4.17%，二者僅相差0.27%;而4 個自交組合種子出苗率平均僅為0.25%。綜上可見，近交造成子代飽滿度及出苗率衰退嚴重，而種子飽滿度及出苗率則與父母本基因型有關。

表2列出了鵝掌楸不同交配類型子代種子飽滿度、出苗率及其標準差比較結果表明，種內交配子代種子飽滿度與出苗率均最高，分別為27.54%、9.29%，飽滿度高出種間雜交、回交、自交子代的33.30%、89.02%、610. 00%;而出苗率則高出80. 04%、116.00%、3 616.00%;不同交配類型子代種子飽滿度與出苗率變異趨勢是一致的，即:種內＞種間＞回交＞自交。

表2 鵝掌楸不同交配類型種子飽滿度與出苗率 %

表3列出了鵝掌楸不同交配類型間及交配類型內組合間種子飽滿度及出苗率方差分析結果，二者在重復間差異均不顯著，而在交配類型間及交配類型內組合間二者差異均達到了極顯著水平。

表3 鵝掌楸不同交配類型種子飽滿度與出苗率方差分析結果

2.2 不同交配組合/交配類型子代的苗期生長量

對鵝掌楸近交子代苗期生長量研究發現，各交配組合在地徑和苗高上均存在明顯差異。對于地徑生長:變異系數從LS×NK 的21.99%到BM×MSL 的60.87%，后者是前者的2.77 倍。在回交組合中，變異系數最大組合為BM×F1(58.77%)，最小組合為LS×F1(23.78%)，前者是后者2.47 倍。正反交組合中除F1與LS 組合外，其余正反交組合中反交組合變異系數均大于正交組合，相差最大的正反交組合為F1×FY(26.53%)、FY×F1(40.91%)，二者相差14.38%。對于苗高生長:變異系數從F1×MSL 的21. 00% 到BM×MSL的58. 22% ，后者是前者的2.77 倍。在回交組合中，變異系數最大組合為F1×NK(53.57%)，最小組合為F1×MSL(21.00%)，前者是后者2.55 倍。在正反交組合中，F1與LS、FY、MSL、LYS 回交組合中反交組合苗高變異系數高于正交組合，而F1與WYS、BM、NK 回交組合則相反(正交大于反交)，相差最大的正反交組合為F1×FY(28.48%)，FY×F1(44.85%)，二者相差16.37%;而自交組合地徑與苗高均值均低于回交組合，可見近交衰退嚴重。

表4列出了鵝掌楸不同交配類型子代苗期生長量。由表4可看出，子代苗期生長在不同交配類型間差異較大，地徑與苗高生長量由大到小順序為:種間雜交、回交、種內雜交、自交。

表4 鵝掌楸不同交配類型子代苗期生長量比較

表5給出了不同交配類型子代苗期生長量的方差分析結果。苗高與地徑在交配類型間差異極顯著，同時，在交配類型內組合間差異也達極顯著水平。

表5 鵝掌楸不同交配類型苗期生長性狀方差分析結果

2.3 鵝掌楸近交組合子代的衰退表現

根據不同交配類型子代種子飽滿度及出苗率結果(表2)，利用近交衰退估算公式可以得出，相對于種內交配，回交、自交組合子代種子飽滿度近交衰退指數δ 分別為0.47、0.86;種子出苗率近交衰退指數δ 分別為0.54、0.97，近交組合平均飽滿度與出苗率衰退指數均高于種間交配組合子代，近交衰退明顯。值得注意的是，與種內雜交組合子代相比，種間雜交組合子代在飽滿度與出苗率2 個表型上也有一定程度的降低，這可能是由于鵝掌楸2 個種由于長期的地理隔離導致一定程度的生殖隔離，進而在子代適合度上表現出較低水平的遠交衰退。

根據不同交配組合苗期生長量分析結果(表4)，利用近交衰退估算公式可以得出，相對于種間雜交，種內雜交、回交及自交組合子代平均地徑近交衰退指數δ 分別為0.48、0.16、0.49。平均苗高近交衰退指數δ 分別為0.32、0.27、0.35。自交組合平均地徑與苗高衰退指數大于種內雜交子代，可見自交子代苗期生長量近交衰退明顯。而回交組合子代地徑與苗高衰退指數小于種內雜交子代，分析可能原因為本研究中的回交組合為三交種，并非真正意義上的回交，涉及2 個種之間的基因交流，而種內交配組合僅為單個種之間的基因交流。

2.4 不同交配類型子代的固定指數

由不同交配類型子代固定指數(表6)可以看出，不同交配類型子代固定指數均小于0，表明雜合子過量。鵝掌楸是一個高度雜合樹種，具有蟲媒異交特性，使其保持了較高的雜合度，這可能是本研究中使自交子代雜合子偏多的原因，從而導致固定指數F＜0。自交子代固定指數最高，為-0.136 5，種間雜交子代固定指數最低，為-0. 5558，二者相差0.419 3，不同交配類型子代含雜合子由高到低變異趨勢為:種間雜交、種內雜交、回交、自交。

表6 鵝掌楸不同交配類型子代固定指數

2.5 不同交配組合/交配類型子代SSR 純合子比率

對不同組合子代純合子比率研究發現，不同組合子代純合子比率差異較大，最大為MSL 自交組合(7 9. 1 7% )，最小為種間交配WYS×BM，僅為10.83%，二者相差68.34%。而不同回交子代中純合子比率變異幅度也較大，F1×WYS 最大，為48.33%，F1×BM 最小，為17.50%，二者相差30.83%;而F1與鵝掌楸交配子代純合子比率較F1與北美鵝掌楸交配子代有明顯增大。正反交組合子代純合子比率并不完全一致，其中F1×LS 與LS×F1相差最大，為7.50%，F1×NK 與NK×F1相差最小，為1.12%。

從不同交配類型子代純合子比率可以看出，自交子代純合子比率均值最高，為78.77%，種間雜交子代純合子比率均值最低，為21.59%，二者相差57.18%，自交子代純合子比率均值分別高出種內雜交、回交、種間雜交子代的1.04、1.35、2.65 倍;不同交配類型子代純合子比率均值由高到低變異趨勢為:自交、種內雜交、回交、種間雜交。

表7 鵝掌楸不同交配類型子代的純合子比率 %

表8列出了鵝掌楸不同交配類型子代純合子比率的方差分析結果。在4 種交配類型間，各交配類型組合間以及不同位點間的純合子比率差異均達極顯著水平，說明不同交配類型子代的純合子比率差異顯著。

表8 鵝掌楸不同交配類型子代純合子比率方差分析結果

2.6 鵝掌楸、北美鵝掌楸交配親本的基因雜合度

通過對4 個鵝掌楸及4 個北美鵝掌楸親本在12 個不同位點觀測基因雜合度研究發現:LYS、NK、MSL、BM、FY、WYS、SZ、LS 親本基因雜合度分別為58.33%、41.67%、33.33%、25.00%、25.00%、25.00%、25.00%、16.67%，據此推算4 個北美鵝掌楸親本(LYS、NK、MSL、BM)基因雜合度平均為39.58%;4 個鵝掌楸親本(FY、WYS、SZ、LS)基因雜合度平均為22.92%，北美鵝掌楸基因雜合度平均高出鵝掌楸16.7%。

3 結論與討論

3.1 植物近交衰退的度量

近交衰退既可以從表型上檢測，也可以從基因型水平來分析。植物近交衰退的表型檢測多采用與適合度有關的性狀，如開花數量、結實率、種子大小、飽滿度、發芽率、生長量(株高、胸徑及體積)等［19］，也有采用生理生化指標(如光合作用參數)來檢測［20］。從基因型水平，一般采用基因組信息的電泳數據來間接測定［3］，如用固定指數F 來度量近交程度。

度量近交衰退程度的參數主要有近交衰退系數δ、累計成活率Vi及致死當量α 等。近交衰退系數δ實際為相對適合度，通常被定義為1 減去近交子代相對于異交子代的適合度，即:δ=1-Ws/Wo，該方法能夠較方便地測定種群的近交衰退，是目前最常用的度量近交衰退的參數［15］。累計成活率Vi利用種子出苗率(Vg)、苗期成活率(Vs)及胚的存活率(Ve種子數與初始胚的數量的比值)來度量近交衰退，即Vi=Ve×Vg×Vs［21］，若異交子代總體均值顯著大于自交子代，則該群體近交衰退明顯。此外，近交衰退也可用純合致死等位基因的數量即致死當量α 來度量，即α=-4lnR［22］，其中R 表示自交子代相對于異交子代的相對適合度，致死當量在不同物種及個體間變化很大，在農作物及動物間變化范圍分別為1.2 ～5.2，1.0 ～4.0，而在林木中致死當量往往大于5.0，這可能與林木為高度異交物種，基因高度雜合，蘊含了大量隱性不利基因有關。

3.2 鵝掌楸、北美鵝掌楸親本雜合度

在群體遺傳學研究中，基因雜合度是衡量群體遺傳變異的一個重要指標［23］，在個體數有限的小群體內，隨著世代繁育，勢必增加近交的幾率，導致群體基因雜合度下降，遺傳變異或遺傳多樣性降低，從而造成近交衰退的發生［24］。本研究對鵝掌楸(LS、FY、SZ、WYS)、北美鵝掌楸(LYS、MSL、BM、NK)親本在12 個不同位點的基因雜合度進行了定量估算，發現北美鵝掌楸雜合度(3 9. 5 8% )高于鵝掌楸(22.92%)，可能的解釋為，與鵝掌楸相比，北美鵝掌楸種群規模大、分布范圍廣、近交幾率相對較低。本研究結果僅對來自鵝掌楸、北美鵝掌楸各4 個親本進行比較分析，數量偏少。因此，下一步筆者將增加親本及交配組合子代數量，對此作進一步驗證。

3.3 鵝掌楸近交衰退狀況及涵義

在現存的鵝掌楸種群中，大部分個體數量很少。賀善安等在對長江流域以南亞熱帶廣袤地域內84個鵝掌楸分布點研究發現，個體數在1 ～20 株的分布點有60 個，百株以上的分布點僅5 個［25］。從鵝掌楸天然分布(呈島狀星散分布)形式來看，鵝掌楸正處在被分割、隔離及孤立的狀態，其基因交流會進一步受到阻礙，遺傳多樣性也會進一步降低;天然群體的更新能力也較差，整個物種處于瀕危狀態。另有研究發現，鵝掌楸天然群體種子發芽率極低，一般都在5%以下，有的甚至不到1%，造成這種情況的直接原因可能與種群規模過小，授粉條件差有關［26］24。從遺傳學的角度看，小種群間基因交流受阻勢必會造成種內近交的發生從而出現近交衰退現象。本研究發現自交子代出苗率平均為0.25%;近交衰退指數δ 為0.97，這意味著自交子代適合度接近于0，可見近交衰退嚴重。研究還發現種間交配組合子代飽滿度與出苗率均低于種內組合，原因可能是種間組合親本間存在生殖隔離而使其雜交親和度下降所致;而對苗期生長量的研究發現，近交子代(回交)近交衰退表現不明顯，這可能與試驗期短有關，也可能是由于自然選擇的作用使有害基因淘汰的結果［27］，即自然選擇的作用有利于保存那些使生物有較強適應能力的基因。

對于現有的鵝掌楸天然群體，當前急需采取措施避免現有種群發生嚴重的近交衰退。如禁止盜伐，防止其種群規模進一步縮小;同時，可考慮引入新的種質，擴大種群規模，促使種群間基因交流與重組［26］24-25;也可在母樹樹冠下方或周圍，在種子散落前進行局部雜灌清理，以促進鵝掌楸自然更新。或者采用遷地保護措施，有計劃地在天然群體中采集優良單株的穗條進行嫁接，建立種質資源庫。

此外，基于鵝掌楸近交衰退嚴重，因此，在鵝掌楸雜交育種及雜種優勢利用時，應盡可能避免利用F1代的回交子代。

［1］ 曾燕如，徐岳雷，翁志遠，等.林木群體中的交配系統［J］.浙江林業科技，2002，22(6):42-45.

［2］ 張大勇，姜新華.植物交配系統的進化、資源分配對策與遺傳多樣性［J］.植物生態學報，2001，25(2):130-143.

［3］ 陳小勇，宋永昌. 黃山釣橋青岡種群的交配系統與近交衰退［J］.生態學報，1997，17(5):462-468.

［4］ 王崢峰，彭少麟，任海.小種群的遺傳變異和近交衰退［J］. 植物遺傳資源學報，2005，6(1):101-107.

［5］ 陳小勇，林鵬.廈門木麻黃種群交配系統及近交衰退［J］.應用生態學報，2002，13(11):1377-1380.

［6］ Charlesworth B，Charlesworth D. The genetic basis of inbreeding depression［J］. Genetical Research，1999，74:329-340.

［7］ Charlesworth D，Charlesworth B. Inbreeding depression and its evolutionary consequences［J］. Annual Review of Ecology and Systematics，1987，18:237-268.

［8］ Holsinger K E. Inbreeding depression doesn’t matter:The genetic basis of mating system evolution［J］. Evolution，1988，42(6):1235-1244.

［9］ K?rkk?inen K，Koski V，Savolainen O. Geographical variation in the inbreeding depression of Scots pine［J］. Evolution，1996，50(1):111-119.

［10］ Schierup M H，Christiansen F B. Inbreeding depression and outbreeding depression in plants［J］. Heredity，1996，77:461-468.

［11］ 張富云，趙燕.鵝掌楸屬植物研究進展［J］.云南農業大學學報，2005，20(5):697-701.

［12］ 郝日明，賀善安，湯詩杰，等. 鵝掌楸在中國的自然分布及其特點［J］.植物資源與環境，1995，4(1):1-6.

［13］ 李火根，陳龍，梁呈元，等. 鵝掌楸屬樹種種源試驗研究［J］.林業科技開發，2005，19(5):13-16.

［14］ 顏啟傳.種子檢驗原理和技術［M］. 杭州:浙江大學出版社，2002.

［15］ Johnston M O，Schoen D J. On the measurement of inbreeding depression［J］. Evolution，1994，48(5)，1735-1741.

［16］ 馮源恒，李火根，張紅蓮.鵝掌楸配子選擇與雄性繁殖適合度［J］.植物學報，2010，45(1):52-58.

［17］ Xu Meng，Li HuoGen，Zhang Bo. Fifteen polymorphic simple sequence repeat markers from expressed sequence tags of Liriodendron tulipifer［J］. Molecular Ecology Notes，2006，6:728-730.

［18］ 向華，毛盛賢.固定指數理論及其在遺傳育種中的應用［J］.遺傳，1995，17(增刊):63-70.

［19］ 王崢峰，傅聲雷，任海，等.近交衰退:我們檢測到了嗎［J］.生態學雜志，2007，26(2):245-252.

［20］ Johnsen K，Major J E，Maier C A. Selfing results in inbreeding depression of growth but not of gas exchange of surviving adult black spruce trees［J］. Tree Physiology，2003，23:1005-1008.

［21］ Ishida K. Maintenance of inbreeding depression in a highly selffertilizing tree Magnolia obovata Thunb［J］. Evolutionary Ecology，2006，20:173-191.

［22］ White T L，Adams W T，Neale D B. Forest Genetics［M］. Oxfordshire:CAB International，2007.

［23］ 牛麗莉，李宏濱，杜立新.分子標記在家畜遺傳多樣性研究中的應用［J］.生物技術通訊，2008，19(2):299-302.

［24］ 魯紹雄，毛華明，魯立剛，等. 隨機留種下閉鎖群體近交系數和基因雜合度的世代變化［J］.中國畜牧獸醫，2010，37(5):151-154.

［25］ 賀善安，郝日明，湯詩杰.鵝掌楸致瀕的生態因素研究［J］.植物資源與環境，1996，5(1):5-8.

［26］ 王章榮.鵝掌楸屬樹種雜交育種與利用［M］.北京:中國林業出版社，2005.

［27］ Brandon R N. The difference between selection and drift:a reply to Millstein［J］. Biology and Philosophy，2005，20:153-170.