針刺對急性骨骼肌鈍挫傷大鼠肌衛星細胞增殖的影響

李俊華，王正珍，王軍力，唐云峰

挫傷和拉傷是運動醫學臨床上常見的骨骼肌損傷。挫傷后所引起的肌肉組織的血腫機化、瘢痕修復不僅影響運動員的運動能力，且對運動壽命構成了潛在威脅，是造成全球運動員困擾的難題之一［6］。

斜刺阿是穴治療骨骼肌損傷，具有療效高、見效快、療程短、療效持久穩定、費用低、操作簡便等顯著優點。它不僅適用于運動引起的骨骼肌損傷，也適用于體力勞動和日常生活所引起的骨骼肌損傷，并對各年齡段患者的急性和慢性損傷都有很高的療效。阿是穴斜刺能夠迅速加強肌肉收縮蛋白的組裝合成，使收縮結構和功能恢復正常、疼痛消失，因而療效持久、穩定。本研究采用針刺治療骨骼肌損傷，用自然愈合作為對照，比較并觀察骨骼肌鈍挫傷后針刺對骨骼肌損傷修復過程中肌衛星細胞增殖的影響，探討針刺對骨骼肌損傷修復的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，8周齡，體重220～250g，級別：SPF，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.1.2 主要實驗儀器

1.蘇州針灸用品有限公司生產的環球牌一次性無菌針灸針：0.25×40 mm，XSZ－H光學顯微鏡。

2.ERMAINC切片機；KD－BM生物組織包埋機；MIAS醫學頭像分析管理系統。

1.1.3 實驗主要試劑

小鼠抗大鼠增殖細胞核抗原（PCNA），即用型SABC試劑盒，一抗稀釋液，DAB顯色試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗大鼠骨骼肌鈍挫傷模型的建立

大鼠購進后適應性喂養2天，參照Kami等［18］的方法，制作本次實驗的大鼠骨骼肌鈍挫傷模型：即2％戊巴比妥鈉，按0.25 ml/100 g［7］劑量進行腹腔注射，大鼠麻醉后俯臥位固定四肢，伸膝、踝背屈90°，用自制打擊裝置從15 cm高處自由垂直落下打擊大鼠右小腿內側面（其皮下為腓腸肌中段），打擊面直徑1.0 cm，下落物體長20 cm，重500 g，重力7.96 N，動能2.54 J。經解剖證實大鼠腓腸肌鈍挫傷成功率100％。損傷程度相當于人體中度挫傷。

1.2.2 實驗分組和治療方案

將60只大鼠隨機分為正常組6只，造模后隨機分為即刻組6只、自然愈合組24只和針刺治療組24只。自然愈合組（對照組）和針刺治療組（實驗組）又根據取材時間進一步分為損傷后第1天、第2天、第4天和第6天組。針刺治療組在損傷局部進行針刺治療，采用蘇州針灸用品有限公司的環球牌一次性無菌針灸針0.25×40 mm，取阿是穴，以損傷為中心，距損傷15 mm處進針，斜刺。每天1次，留針，每次15 min，共針刺6天。自然愈合組不采用任何方法治療，自然愈合。

大鼠阿是穴選取的依據：早在2000年前《靈樞經·經筋第十三》就有關于治療肌肉損傷的記載要“以痛為腧”，就是現在的“阿是穴”；《靈樞經·官針第七》中記載的針法“浮刺”、“合谷刺”等都是斜刺。盧鼎厚在繼承這一方法的20多年的實踐中把“以痛為腧”發展為“以損傷的肌束為主、疼痛為輔”確定阿是穴［3］，斜刺針法不變。在找到人體阿是穴的理論依據的同時，查閱相關針灸動物實驗和獸醫針灸學文獻發現，動物穴位的確定模擬人體穴位的居多，但穴位的比例比人體穴位的比例小。因此，本研究采用盧鼎厚的“以損傷的肌束為主、疼痛為輔”確定人體阿是穴的理論作為確定本次實驗大鼠的阿是穴選取和定位的依據。

1.2.3 測試樣本采集與制備

燒杯內倒入正己烷，并把燒杯懸吊于溫度可達－73℃的干冰容器內，杯底與干冰液面接觸，待裝有正己烷的燒杯底呈現白霜時即可。每組從6只大鼠中隨機取4只稱重后，用2％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，0.25 ml/100 g，腹主動脈取血后，速取右側損傷處腓腸肌并將其切成小塊，投入用干冰預冷的裝有正已烷（－70℃）的小燒杯中速凍，之后取出用錫紙編號、包好，冰凍暫存。取材完成后把腓腸肌標本轉移至－80℃冰箱保存，備用。

1.2.4 PCNA檢測

采用常規三步免疫組化法，按試劑盒說明進行操作。以PBS代替一抗作陰性對照，結果在鏡下細胞核內信號呈棕黃色顆粒者為PCNA陽性。每張切片選取5個肌衛星細胞陽性最多的視野。所有圖像用MIAS醫學頭像分析管理系統進行組織切片的圖像分析，測定腓腸肌衛星細胞的面密度，對其進行定量分析。

1.2.5 數理統計

使用統計學分析軟件SPSS 13.0 for Windows對數據進行統計學處理，所有數據以平均值±標準差（±SD）表示。組間組內均采用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 研究結果

2.1 針刺治療組大鼠骨骼肌損傷后不同天數肌衛星細胞增殖情況

在光鏡下見正常組和損傷即刻組大鼠腓腸肌衛星細胞PCNA陽性核表達均為陰性。

傷后第1天，針刺治療組大鼠腓腸肌中肌衛星細胞PCNA陽性核開始出現；傷后第2天，肌衛星細胞PCNA陽性核數目急劇增加達高峰，與第1天、第4天、第6天比較均有極顯著性差異（P＜0.01），之后呈下降趨勢；傷后第4天肌衛星細胞PCNA陽性核數目降至第2天的約1/2倍，但高于第1天和第6天，與之比較均有顯著性差異（P＜0.05）；傷后第6天肌衛星細胞PCNA陽性核數目降至6天來最低水平，與第1天比較無顯著性差異（表1）。

表1 本研究不同天數針刺治療組與自然愈合組大鼠肌衛星細胞增值情況一覽表 （±SD）

表1 本研究不同天數針刺治療組與自然愈合組大鼠肌衛星細胞增值情況一覽表 （±SD）

注：＊表示兩組在傷后不同天數肌衛星細胞增殖的比較，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。

傷后第1天 傷后第2天 傷后第4天 傷后第6天針刺治療組 0.007±0.0044 0.0344±0.014＊＊ 0.01735±0.0146＊0.0065±0.00283自然愈合組 0.0047±0.0036 0.00768±0.00355＊ 0.0115±0.0058＊＊0.0081±0.0066

2.2 自然愈合組大鼠骨骼肌損傷后不同天數肌衛星細胞增殖情況

傷后第1天，自然愈合組大鼠腓腸肌中肌衛星細胞PCNA陽性核也開始出現；傷后第2天，大鼠腓腸肌中肌衛星細胞PCNA陽性核繼續增加，與第1天比較有顯著性差異（P＜0.05）；在損傷后第4天達高峰，與第1天比較有極顯著性差異（P＜0.01），與第2天比較有顯著性差異（P＜0.05），之后呈緩慢下降趨勢；傷后第6天，肌衛星細胞PCNA陽性核略高于第2天水平，與之比較無顯著性差異，但與第1天、第4天比較均有顯著性差異（P＜0.05；表1）。

2.3 不同天數針刺治療組與自然愈合組大鼠骨骼肌損傷后肌衛星細胞增殖比較

與自然愈合組比較，針刺治療組大鼠腓腸肌中肌衛星細胞PCNA陽性核數呈急升快降趨勢，而自然愈合組則呈緩升緩降趨勢，同時，肌衛星細胞PCNA陽性核數達高峰的時間明顯早于自然愈合組。在數量上，傷后第1天、第4天針刺治療組肌衛星細胞PCNA陽性核數略高于自然愈合組，傷后第6天略低于自然愈合組，但兩組比較均無顯著性差異（P＞0.05），在傷后第2天，卻明顯高于自然愈合組，2組比較有極顯著性差異（P＜0.01，表1；圖1）。

圖1 不同天數針刺治療組與自然愈合組肌衛星細胞增殖情況比較示意圖

3 分析與討論

3.1 大鼠損傷后骨骼肌衛星細胞增殖活性變化情況

在整個骨骼肌再生的過程中，決定整個肌肉再生最重要的2個階段是巨噬細胞吞噬壞死組織和衛星細胞被激活。但就肌肉再生這一過程，主要是由衛星細胞來完成的。骨骼肌損傷后肌纖維的再生來源主要是肌衛星細胞的分化。

從分子生物學的角度看，肌衛星細胞的激活以及增殖分裂，最后形成成熟的肌纖維是一個非常復雜的過程。肌衛星細胞的活化一般出現在巨噬細胞開始吞噬壞死的纖維后，說明衛星細胞的激活與巨噬細胞分泌的某些物質有關，此外，肌衛星細胞的激活還受其他因素的調節。

肌肉損傷后引起肌纖維壞死，使趨向死亡的組織部位的衛星細胞出現增殖、愈合、形成新的肌纖維，取代以前的壞死纖維。在肌纖維修復過程中，壞死部位、整根肌纖維及壞死纖維周圍正常肌纖維的肌衛星細胞都會移行到壞死部位參與修復反應［14，15］。

骨骼肌損傷后，對肌衛星細胞出現的時間有不同的結論，Hurme發現，骨骼肌損傷后第1天損傷區域沒有肌衛星細胞出現，第4天再生區肌衛星細胞增生活躍，第7天肌衛星細胞數量下降。但也有研究發現，肌肉發生損傷后24 h內，在損傷部位出現組織的變性和炎癥反應的同時，衛星細胞已經出現，并且由于受到損傷刺激的影響，衛星細胞已被激活，并開始表現出分裂和增殖。如Timo等［16］通過實驗得出，衛星細胞在肌肉損傷后1天已開始增殖，Bischoff的衛星細胞增殖時間在損傷后18 h出現。

本研究發現，自然愈合組大鼠在損傷后第1天就有肌衛星細胞PCNA陽性核出現，傷后第2天肌衛星細胞PCNA陽性核數繼續增加；在傷后第4天達高峰，損傷后第6天下降至略高于第2天的水平，這與前人的研究結果基本一致，即損傷后24 h肌衛星細胞被激活，第4天達峰值，第6天肌衛星細胞數量下降，與前人的研究結果基本上是一致的。

3.2 針刺對急性骨骼肌鈍挫傷大鼠肌衛星細胞增殖的影響

本研究證明，針刺可以促進損傷肌組織肌衛星細胞的增殖及增殖高峰期提前出現。與自然愈合組相比，針刺治療組大鼠腓腸肌中肌衛星細胞PCNA陽性核數呈急升快降趨勢，傷后第2天達高峰，傷后第4天降至第2天的一半，而自然愈合組則呈緩升緩降趨勢，同時，肌衛星細胞PCNA陽性核數達高峰的時間明顯早于自然愈合組。針刺治療組肌衛星細胞PCNA陽性核數在損傷后第2天就達高峰，早于自然愈合組的第4天高峰時間。在數量上，針刺治療組在傷后第2天明顯高于自然愈合組，兩組比較有極顯著性差異（P＜0.01），傷后第1天、第4天僅略高于自然愈合組，傷后第6天略低于自然愈合組，但兩組比較均無顯著性差異。表明針刺治療組大鼠腓腸肌衛星細胞的活化、增生更為活躍，增殖高峰期出現的時間更早，提示，針刺可以有效促進損傷肌組織肌衛星細胞的增殖及增殖高峰期提前出現。依此推測針刺可能通過促進肌衛星細胞的增殖及增殖高峰期提前出現，促進肌肉的再生和修復。

3.3 針刺促進急性骨骼肌鈍挫傷大鼠肌衛星細胞增殖的可能機制

近年來，臨床上運用針刺治療骨骼肌急、慢性損傷的療效研究頗多，均證實療效很好，但對其作用機制的研究尚不全面。一些人體和動物實驗證明，針刺能促進損傷骨骼肌的結構和功能的恢復。李澎濤等［2］通過實驗證實，針刺能顯著改善家兔超負荷運動后損傷骨骼肌超微結構的變化，同時還能迅速降低因運動后增高的骨骼肌細胞內鈣離子的濃度。1995年屈竹青等［5］再次證實，針刺能迅速降低肌肉損傷后肌細胞胞漿內增加的鈣濃度，加快結構恢復。盧鼎厚［3］通過人體研究指出，阿是穴斜刺能有效治療運動員和非運動員的急、慢性肌肉損傷，其作用機制是針刺通過加強收縮蛋白的組裝、合成而促進肌肉的結構和功能恢復。同時，他也指出，阿是穴斜刺促進肌肉結構和功能恢復的作用是通過肌肉本身所固有的外周調節機制實現的，而并不是通過經絡和神經體液的整體調節或中樞調節來實現。王瑞元［10］研究發現，斜刺可以阻遏大鼠大負荷運動引起的F－肌動蛋白（F－actin）延遲性解聚加強，并促進大鼠大負荷運動后作為骨骼肌再生指標的肌球蛋白重鏈MHC基因表達的恢復和骨骼肌超微結構變化的恢復。

骨骼肌損傷后再生的過程主要是由肌衛星細胞來完成的，而大量研究證實，肌衛星細胞的增殖、分化受多種因素的影響，如胰島素樣生長因子－1（IGF－1）、成纖維生長因子（FGF）、生肌調節因子（MRFs）等細胞因子以及低功率激光、脈沖超聲波、不同頻率張應變刺激等物理因素［1，8，11］。Jennische等［17］曾在大鼠的骨骼肌損傷模型中發現，IGF－1在傷后24 h內即可出現，分布在傷側肌組織的衛星細胞中。低功率激光照射能顯著地促進急性骨骼肌鈍挫傷大鼠損傷局部肌組織IGF－1 mRNA的表達［4］。IGF－1不僅可促使細胞分裂增殖，還對生肌調節因子的功能有一定的影響。IGF－1調節肌衛星細胞的機制可能是利用如鈣調神經磷酸酶、3－羥基—磷酸肌醇激酶、有絲分裂原激酶等多條信號傳導途徑進行調節，也可能是直接刺激衛星細胞增生過程［13］。羅麗［4］用低功率激光照射急性骨骼肌鈍挫傷大鼠發現，在損傷后第1天、第2天、第3天和第7天，激光治療組肌衛星細胞核數目均顯著高于自然愈合組，但變化趨勢大致相同；同時還發現，低功率激光照射能顯著地促進急性骨骼肌鈍挫傷大鼠損傷局部肌組織IGF－1 mRNA的表達。據此作者推測，低功率激光可能通過促進IGF－1 mRNA的表達，從而促進新生肌細胞的蛋白質合成，并通過提高肌衛星細胞增殖活性，促進骨骼肌細胞再生；也可能直接通過促進肌衛星細胞增殖，加速骨骼肌的再生與修復，提高骨骼肌愈合質量。另有研究發現，脈沖超聲波也可明顯促進肌衛星細胞增殖，加快骨骼肌挫傷的愈合速度，提高其愈合質量［12］，但其作用機制尚不清楚。關于針刺調節骨骼肌衛星細胞的激活、增殖的相關研究報道卻很少，僅見史翼鵬等［9］在大強度運動后用針刺干預損傷骨骼肌發現針刺能有效促進生肌調節因子Myf－5的升高，增強衛星細胞的激活與增殖，從而促進骨骼肌損傷修復，但作者并沒有對衛星細胞增殖趨勢進行連續觀察。針刺是否可以通過促進生肌調節因子Myf－5的升高而使衛星細胞在短期內迅速增殖？需要進一步研究。

結合前人的研究結果和本研究中針刺誘發肌衛星細胞短時間內數量增加的事實推測：針刺有可能通過促進損傷骨骼肌內源性IGF－1 mRNA提早表達或/和生肌調節因子Myf－5的升高，從而使肌衛星細胞增殖速度更快，增殖高峰期提早出現；針刺更有可能直接刺激壞死部位的肌衛星細胞和壞死肌纖維周圍正常肌纖維的肌衛星細胞迅速移行到壞死部位一起參與修復反應，但其依據均需要進一步研究證實。

4 結論

1.經針刺治療后，大鼠骨骼肌衛星細胞增殖在第2天達到高峰，而后呈下降趨勢，提示，針刺可促進肌衛星細胞增殖活躍期提前出現。

2.自然愈合組大鼠骨骼肌衛星細胞增殖在第1～4天呈遞增情況，在第4天達到高峰后呈緩慢遞減趨勢。

3.與自然愈合組相比較，大鼠骨骼肌損傷后針刺組肌衛星細胞值在第1天、第2天和第4天均高于自然愈合組，且在第2天有極顯著性差異。提示，大鼠骨骼肌損傷后，針刺能促進肌衛星細胞的增殖并促使活躍期提前出現，促進骨骼肌細胞再生，加速損傷愈合的進程。

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