凝膠色譜法測定頭孢菌素中高分子雜質心得

孫鳳岐 孫曉磊

摘要：本文敘述了凝膠色譜法測定頭孢菌素中高分子雜質心得。

關鍵詞：抗生素實驗準備凝膠色譜柱操作方法

抗生素類藥物中的高分子雜質是指藥品中分子量大于藥物本身的雜質，分子量一般在1000～5000，個別可至10000道爾頓左右。頭孢菌素類藥物中的高分子雜質主要成分為蛋白（多肽）類雜質和聚合物雜質兩類，前者主要來自生產過程的殘留或污染，后者主要是抗生素在生產、貯存和使用條件下發生的分子間的聚合反應產物。國內外大量的實驗及臨床研究證明，抗生素所致的速發型過敏反應和其中的高分子雜質有關，其含量對藥品的質量有很大影響。

為提高藥品純度，減少不良反應的發生，頭孢菌素類品種中高分子雜質的含量，獲得很好效果。

(1)儀器與實驗準備。儀器。采用液相色譜儀測定抗生素高分子雜質含量時，液相色譜儀部分應按國家技術監督局國家計量檢定規程匯編中 實驗室液相色譜儀檢定規程“（JJG705-90）”的規定作定期檢定，應符合規定。儀器的具體使用應詳細參閱各操作說明書。

采用自行配置的簡易儀器或系統應包括輸液單元、檢測單元和記錄及數據處理單元三部分。其中輸液單元應能在實驗過程中提供1m1/min左右穩定的流速，檢測單元應具備滿足標準規定波長在內的紫外檢測能力，同時檢測單元應能向記錄單元（色譜工作站或積分記錄儀）輸出模擬信號，以進行數據的記錄和處理。自行配置的儀器系統可以參照液相色譜儀的檢測規定，擬定自檢規程和能達到的技術指標，并定期檢定，以保證實驗的重現性。

(2)凝膠色譜柱準備。色譜柱體積規格的選擇應根據儀器系統的最大進樣能力、所分析樣品的溶解能力和檢測限度要求綜合考慮。通常凝膠色譜柱的載樣能力（體積）小于柱床體積的2%。一般頭孢菌素抗生素高分子雜質測定的柱床體積應為60m1以上。

玻璃柱管的分端。開口的玻璃柱管可以采用玻璃棉加開口橡膠塞封端，或者在一端燒結石英過濾板，也可以直接購買帶調節頭的商品玻璃柱管。

凝膠介質。凝膠色譜法可選用的凝膠有多種，目前中國藥典中抗生素高分子雜質測定時多采用葡聚糖凝膠SephadeXG10.Sephade XG10通常為干粉，用前需用水充分溶脹。每1g SephadeXG10干粉溶脹后的柱床體積約2-3m1,可以根據需要填制的凝膠柱柱床體積計算SephadeXG10干粉的用量。溶脹采用蒸餾水浸泡，可在4℃冰箱中放置48小時，也可在水浴中煮沸一小時，以保證溶脹充分。在兩種溶脹方式中，均應隨時攪拌出去氣泡，如有必要還可進一步真空脫氣。

裝柱。將溶脹好的凝膠介質用蒸餾水懸浮，靜置后，每次傾去上層液，以去除凝膠碎屑和雜質。如此洗滌次數，直至上層精置液澄清為止。

可將凝膠介質用水制成70%（V/V）DE 懸漿，一次倒入垂直放置的玻璃柱管，待凝膠顆粒沉降完畢后即完成裝柱。也可在垂直放置的玻璃柱管和漏斗，放開柱管下口，保持液流順暢，用滴灌逐管從漏斗中加入凝膠懸漿，讓凝膠顆粒在蒸餾水中緩慢沉降，注意讓漏斗中隨時保持一定的凝膠懸漿。此法裝柱時間較長，必要時可以在出柱口增加負壓加快裝柱時間。新填裝的色譜柱要先用水連續沖洗4～6小時，促使凝膠更緊密均勻地填充在柱管中。

凝膠柱的維護。凝膠柱應保證柱床連續、均一、平整，如發現凝膠收縮、變干斷層或出現氣泡，應將凝膠從柱管中倒出，重新裝柱。如果僅僅在柱頭發現少許污染或破壞，可用小勺將該部分凝膠挖掉棄去，加入少量流動相或水，用玻棒輕輕擾動凝膠面，靜置，待凝膠顆粒重新沉降后封閉柱頭即可。

凝膠柱恢復。一般測量方法中均可采用高濃度、大體積進樣提高檢測能力。可能在色譜柱中發生嚴重非特異性吸附，一方面可能改變凝膠色譜柱的分離機制，另一方面有可能造成柱堵塞，柱壓升高。此時應對凝膠進行恢復處理。

凝膠柱保存。溶脹的凝膠以及凝膠色譜柱可保存在0.02%的NaN3或20%的乙醇溶液中，以控制微生物的生長。

系統適用性實驗。系統適用性試驗包括下列內容：

考察對照品測定系統與高分子雜質測定系統中藍色葡聚糖2000溶液峰的保留時間的比值、理論板數和拖尾因子，來控制對照品測定與高分子雜質測定時儀器狀態的同一性；

以藍色葡聚糖2000的保留時間來表示高分子雜質的保留特征，考察對照品色譜峰及高分子雜質色譜峰與藍色葡聚糖2000溶液色譜峰保留時間的比值均應不超過某一限度，從而控制色譜柱狀態是否正常；

考察對照品溶液重復進樣后峰面積的相對標準偏差應符合規定。

(3)操作方法。樣品溶液的制備。按標準規定配制樣品溶液。由于某些高濃度抗生素溶液不穩定，通常要求樣品溶液即溶即進。

對照溶液的制備。頭孢菌高分子雜質含量測定，通常以樣品自身在SDS水溶液或純水中的締合物作為對照進行定量。在制備締合物時，應注意對濃度、水的純度等條件的控制，以保證締合完全。

進樣。頭孢菌素高分子雜質含量測定對照溶液分別在不同流動相狀態下進樣，更換流動相后凝膠色譜柱應充分平衡后才能進樣。

進樣方式可以采用色譜儀自動進樣，也可以采用手動方式。兩種進樣方式均要求色譜柱端沒有死體積，以避免樣品擴散，造成峰展寬甚至影響分離。自動進樣操作可以參照有關液相色譜操作規程進行，手動進樣方式主要用于開口柱。

手動進樣方式，應凝膠面表面平整。進樣前用滴灌輕輕吸掉凝膠上的液體，保持色譜柱下端流暢，待柱內液體剛剛降至凝膠面之下時，用定量器具精密量取規定體積的樣品溶液小心加入到色譜柱凝膠表面上，待樣品溶液剛剛降至凝膠表面以下時，吸取少量流動相沿色譜柱管內壁緩緩加入，以洗下殘留在色譜柱管壁的樣品溶液，再從柱頂端加入一定量的流動相，并恢復流路，開始記錄進樣時間。

(4)分別記錄樣品和對照溶液的色譜圖，積分對照溶液的峰面積和樣品溶液中處于外水體積的高聚物雜質面積，按外標法以峰面積計算樣品中高分子雜質的含量。

(5)結果與判斷。按平行實驗的平均值作為樣品中高分子雜質含量的最終結果，并與標準規定限度比較，作出是否符合規定的判斷。

(6)樣量分析。如果在一般高效液相色譜儀上使用凝膠柱，應將泵壓嚴格限制在1Mpa以內。并且，由于一般高壓液相色譜管路和檢測器通路狹窄，容易堵塞，應盡量減少將出柱液連接到檢測器的時間，尤其新填充的色譜柱，應經水或流動相充分平衡后再連接到檢測器。

通過實驗論證根據系統的情況進行樣量分析。