2種原料藥微生物限度檢查方法驗證

姚 華，潘庭峰

《中國藥典》附錄微生物限度檢查法收載的檢驗方法包括平皿法和薄膜過濾法2種，筆者通過實驗建立了維生素C及檸檬酸三乙酯的微生物檢查方法，現(xiàn)報告如下。

1 培養(yǎng)基與藥品

1.1 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷培養(yǎng)基(MUG)，上述培養(yǎng)基均由中檢所提供。稀釋劑:0.9%氯化鈉溶液。

1.2 藥品 維生素 C(蚌埠泰格藥業(yè)有限公司，批號:0908189、0908190、0908191)、檸檬酸三乙酯(蚌埠豐原醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號:080107;080109;080111)。

1.3 菌種 大腸埃希菌［CMCC(B)44 102］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63 501］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉［CMCC(F)98 003］，以上菌種均購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物1 ml加入9 ml 0.9%氯化鈉溶液中，10 倍稀釋至10－4～10－7約為50～100 cfu/ml備用。

取經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基內(nèi)的液體培養(yǎng)物1 ml，加入9 ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－5約為50～100 cfu/ml備用。

取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液3 ml，洗脫孢子，取孢子懸液1 ml加入9 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液中10倍稀釋至10－4～10－6約為50～100 cfu/ml備用。以上各株菌的培養(yǎng)物均為第二代的培養(yǎng)物。

2.2 樣品的制備 取樣品各10 g，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 ml，邊加邊攪拌，混勻，作為1:10的供試液。由于檸檬酸三乙酯為非水溶性供試品，故加入適量司盤80、單硬脂酸甘油酯和聚山梨酯80使其充分乳化后，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成1:10的供試液;由于維生素C溶于水后pH值較低，預(yù)實驗時發(fā)現(xiàn)影響部分菌種的正常生長，故在制備成1:10的供試液后用無菌碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至中性。

2.3 回收率測定 (1)試驗組:取上述供試液采用平皿法，取50～100 cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌菌液同法加入培養(yǎng)皿中，倒入營養(yǎng)瓊脂瓊脂培養(yǎng)基20 ml，放冷，倒置平板，33℃ ～35℃溫度培養(yǎng)48 h;取上述供試液采用適宜的方法處理后，加50～100 cfu白色念珠菌和黑曲霉菌液，倒入改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基20 ml，放冷，倒置平板，25℃培養(yǎng)72 h，觀察結(jié)果。(2)菌液組:取50～100 cfu的菌液，除不加供試品外，其它操作同試驗組。(3)供試品對照組:取上述供試液1 ml，除不加菌液外，其它操作同試驗組。(4)稀釋劑對照組:取pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液1 ml，其它操作同試驗組。(5)驗證實驗:進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各次試驗的菌回收率。(6)菌回收率計算:試驗組的菌回收率(%)=(試驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組的平均菌落數(shù)。稀釋劑對照組菌回收率(%)=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)。(7)判斷標(biāo)準(zhǔn):試驗組和稀釋劑對照組的菌回收率均應(yīng)不低于70%。2組回收率測定結(jié)果，見表1。

表1 樣品回收率測定結(jié)果

2.4 控制菌檢查驗證方法 (1)試驗組:取上述供試液10 ml和大腸埃希菌懸液1 ml接種至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35℃ ～37℃培養(yǎng)24 h。增菌后依照控制菌檢查法進行檢查。(2)陰性菌對照組:取上述供試液10 ml和金黃色葡萄球菌懸液1 ml，接種至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 ml中，增菌后依照控制菌檢查法進行檢查。(3)供試品組:取上述供試液10 ml接種至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，增菌后依照控制菌檢查法進行檢查。(4)稀釋劑組:取pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液10 ml接種至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，增菌后依照控制菌檢查法進行檢查。(5)判斷標(biāo)準(zhǔn):供試品不得檢出大腸埃希菌，試驗組應(yīng)檢出大腸埃希菌，陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。大腸埃希菌檢查培養(yǎng)結(jié)果，見表2。

表2 大腸埃希菌檢查培養(yǎng)結(jié)果

3 討論

3.1 供試品配制方法 由于檸檬酸三乙酯為非水溶性供試品，故需加入適量司盤80、單硬脂酸甘油酯和聚山梨酯80使其充分乳化后，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液制成1:10的供試液;由于維生素C溶于水后pH值較低，預(yù)實驗時發(fā)現(xiàn)影響部分菌種的正常生長，故在制備成1:10的供試液后用無菌碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至中性。

3.2 試驗方法 由表1可知，制備后的維生素C溶液和檸檬酸三乙酯溶液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉生長無影響，其試驗組、稀釋劑對照組回收率均達(dá)70%以上，控制菌試驗組陽性菌生長良好，陰性菌對其無干擾，符合《中國藥典》微生物限度檢查驗證試驗要求。細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查采用平皿法;控制菌檢查采用常規(guī)法檢驗即可。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.附錄79-88.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.附錄107-116.

［3］中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:351-407.

［4］張朝武，周宜開.現(xiàn)代衛(wèi)生檢驗［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:707-805.