電針聯合豐富康復訓練對腦損傷仔鼠腦皮質腦源性神經營養因子表達的影響

王風波，唐明薇，李曉捷

宮內感染(intrauterine infection)是先天性小兒腦損傷的重要因素，所導致的腦性癱瘓不僅是康復醫學難題，更已成為嚴重的社會問題。小兒腦損傷早期治療已是當前兒科學與康復醫學界的熱門課題。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在中樞神經系統的發育、損傷后修復及再生等方面均具有積極而重要的作用。電針和豐富的康復訓練均已成為公認的神經康復治療手段，無論是單純的電針或者康復訓練，均可促使中樞神經元的修復。本實驗基于上述研究成果和理論基礎，采用宮內感染致仔鼠先天性腦損傷模型，觀察仔鼠的腦皮質BDNF陽性表達情況，進而探討早期電針聯合豐富康復訓練對小兒腦損傷的積極治療作用，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級成熟Wistar大鼠57只，其中雌性38只，雄性19只，體質量≥220 g，均由佳木斯大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑 脂多糖(血清型055∶B5，美國SIGMA公司)；羊抗兔BDNF多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色液等(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 腦損傷仔鼠模型制備 制備宮內感染致先天性腦損傷仔鼠模型：雌、雄大鼠常規飼養，自由飲食，2∶1(雌∶雄)合籠，次日上午行陰道涂片檢查，查到精子為妊娠第0天，孕鼠另籠飼養。將31只孕鼠按照隨機數表法分為生理鹽水組(n=5)和脂多糖組(n=26)。脂多糖組孕17 d時，腹腔注射脂多糖450μg/kg?d連續2 d，生理鹽水組腹腔注射同等劑量的生理鹽水。孕22 d前分娩的仔鼠為早產鼠，均予去除。仔鼠出生后，蘇木精-伊紅染色觀察孕鼠胎盤，以大量中性粒細胞浸潤為宮內感染判斷標準。

1.4 分組方法 按照隨機數字表法選取28只生理鹽水組仔鼠為對照組，49只脂多糖組仔鼠再按照隨機數表法分為非干預組28只，干預組21只。

1.5 干預方法 對照組、非干預組仔鼠均常規飼養；干預組接受豐富康復訓練和電針治療。

1.5.1 豐富康復訓練 早期觸摸：第2天即開始用軟毛刷從頭至尾勻速刷動，每次15 min，每天1次，同時予聲光刺激，至第14天。豐富環境刺激：第7天起每天1次置于豐富環境中2 h，每3天改變1次環境，至第28天。康復訓練：第15天起開始進行跑籠訓練、轉棒訓練、平衡木訓練，每天1次，至第28天，每次各10 min。各干預之間間隔1 h以上。

1.5.2 電針 第7天起開始電針干預，結合人與大鼠骨度類比，選取百會、曲池及足三里諸穴。具體操作：仔鼠頂骨正中定百會，橈骨近端關節外側前方凹陷處乃曲池，膝外側腓骨小頭下約5 mm處為足三里；選用直徑0.2 mm、長20 mm的針灸針，進針后覺針下沉緊即可，其中百會平刺入，各穴連接至電針儀，調連續波，頻率5～10 Hz，強度以頭部輕微抖動為度，約為3～5 V，每天1次，每次持續10 min，至第28天。

1.6 觀察指標 對照組和非干預組仔鼠于出生后24 h各處死7只行腦皮質病理學、BDNF表達檢測。各組分別于第14、21、28天各取7只行腦皮質BDNF表達檢測。

腦皮質BDNF檢測：采用SABC免疫組織化學染色法，陰性對照用磷酸鹽緩沖液代替一抗。BDNF陽性細胞的棕黃色免疫陽性顆粒主要在胞漿和細胞膜表面分布，主干樹突和近細胞膜的胞漿染色較深，細胞核處染色相對較淺。每例于腦皮質區取5張切片，每張切片在顯微鏡(400×)下隨機取3個相互不疊加視野，計數陽性細胞，取平均值。

1.7 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以(xˉ±s)表示，兩組間均數比較采用t檢驗,多組間均數比較采用單因素方差分析，非正態分布和方差不齊時，用秩和檢驗。

2 結果

2.1 胎盤病理檢查結果及新生仔鼠腦組織病理改變

干預組和非干預組孕鼠胎盤內可見充血、水腫，大量中性粒細胞浸潤；對照組孕鼠胎盤病理檢測未見類似炎癥反應。干預組和非干預組仔鼠腦組織疏松，核仁不清，膠質細胞大量聚集，血管擴張，并有腦室內出血等現象；對照組仔鼠腦組織結構完整，排列有序，核仁較清楚。

2.2 BDNF表達 第1天：非干預組仔鼠BDNF陽性細胞計數顯著高于對照組(P<0.001)，而后各時相點，除第21天(P<0.01)外，兩組間仔鼠均無顯著性差異(P>0.05)；隨著日齡增加，各組仔鼠BDNF陽性細胞計數逐漸增強，在第21天達到高峰(圖1)，而在第28天呈現下降趨勢；干預組仔鼠在各時相點BDNF陽性細胞計數均顯著強于非干預組與對照組(P<0.001)。見表1。

圖1 各組第21天仔鼠腦皮質BDNF表達(SABC免疫組織化學染色，400×)

表1 各組仔鼠不同時相點腦皮質BDNF陽性細胞計數情況比較

3 討論

BDNF在中樞神經系統的發育、損傷后修復等方面所發揮的重要作用，已有廣泛的研究。中樞神經系統受損后，腦組織的BDNF陽性表達主要在大腦皮層、海馬、杏仁核、梨狀皮層和新皮層等部位，鈣離子內流和谷氨酸神經遞質釋放與BDNF陽性表達關系密切，使受損神經元進行芽生和突觸重塑[1]。Pencea等在成年小鼠的側腦室中融入BDNF，發現紋狀體、丘腦和下丘腦等腦組織中的神經元數量顯著增加，表明BDNF還可促進中樞神經細胞的新生[2]。徐曉曉等分別在缺血缺氧性腦損傷新生鼠模型制備前24 h和模型制備后立即按1 mg/kg的劑量將BDNF注入側腦室，觀察海馬區TrkB和P75的表達情況，發現模型前給藥組和模型后給藥組新生鼠TrkB表達明顯高于對照組和假手術組，模型前給藥組高于模型后給藥組，而P75的表達水平模型前給藥組和模型后給藥組明顯低于對照組和假手術組，P75表達水平以模型組最高，模型前給藥組低于模型后給藥組，說明給予腦損傷新生大鼠BDNF進行干預，可誘導TrkB產生和抑制P75表達，阻斷P75介導的凋亡，保護中樞神經系統，增強神經細胞自我保護能力，而在腦損傷發生之前即給予BDNF，效果優于損傷后干預[3]。實驗證實，BDNF與TrkB相結合產生的相應效應可修復缺血性神經元損傷，促進缺血性損傷后突觸的可塑性，改變中樞神經元形態，提高突觸終末密度，促進軸突和樹突的生長[4]。張三明等觀察局灶性腦缺血大鼠腦組織BDNF的表達，發現缺血壞死區中心的BDNF陽性神經細胞缺失，半暗帶區BDNF陽性神經細胞增多，BDNF水平在早期局灶性腦缺血大鼠的腦皮質、下丘腦和海馬區均有增強，其中以海馬區最為明顯，提示腦缺血損傷后機體可通過調節自身代償機制，促進內源性BDNF的表達，增強中樞神經元抵抗缺血性損傷的能力，促進受損神經元的修復、再生[5]。王占堯等將BDNF加入到單細胞克隆傳代培養的小鼠神經干細胞，發現神經干細胞生長良好，加血清誘導分化后，顯示為神經細胞和星形膠質細胞所組成，提示BDNF可促進神經干細胞向神經元分化[6]。新生大鼠腦組織BDNF陽性表達高峰在20～25日齡，腦損傷后腦組織BDNF蛋白陽性表達不僅與治療窗一致，而且亦隨著中樞神經系統的發育而相應性變化[7]。28日齡大鼠的腦發育水平約等于2周歲兒童，正常情況下，2周歲兒童的中樞神經系統即可發育到接近成熟水平，推測28日齡前的時期可能對大鼠中樞神經系統發育至關重要，此期內大鼠的腦在結構與功能上均可塑性極強，正是本實驗時相點選擇的主要依據。

針刺治療腦損傷歷史悠久，療效肯定，對中樞神經系統的BDNF表達的積極作用也已有了大量的實驗研究。張迪等電針干預學習記憶障礙大鼠百會、風府穴，發現電針組大鼠腦內BDNF表達明顯強于模型組，并通過行為學測定提示癡呆前期大鼠電針干預后學習記憶能力有所改善[8]。王彥春等電針干預局灶性腦缺血大鼠風府穴，電針組大鼠腦皮質BDNF和TrkB表達均明顯強于模型組和假手術組[9]。張向飛等電針干預脊髓全橫斷小鼠督脈穴位：電針、命門、中樞、懸樞，觀察大腦皮質運動區BDNF和BDNFmRNA表達，結果顯示電針干預組小鼠BDNF蛋白表達高于對照組，而兩組間BDNF mRNA表達比較無明顯差異[10]。鄒偉等用“百會”透“曲鬢”頭針療法干預急性腦出血大鼠，設定造模后6 h、l d、2 d、3 d、7 d 5個時間窗，觀察血腫周圍腦組織BDNFmRNA的表達情況，發現各時間窗頭枕組大鼠BDNFmRNA表達均顯著強于模型組，且高峰期在腦出血后第2天，之后呈逐漸下降趨勢[11]。王哲等眼針干預急性腦缺血再灌注損傷3 h后大鼠，分別取肝區、上焦區、下焦區、腎區針刺，觀察海馬區BDNF表達情況，結果顯示，眼針組大鼠BDNF蛋白表達及基因表達均高于模型組，并且眼針組神經功能缺損評分低于模型組[12]。

豐富康復訓練不僅可促進腦損傷后中樞神經系統重塑和神經干細胞分化，對BDNF表達的影響也有了一些實驗研究。李紅玲等對出血性腦損傷大鼠術后第72 h開始進行運動訓練，分為術后第7、14、2l、28天共4個時相點，各時相點運動訓練組大鼠腦組織BDNF表達均明顯高于對照組和假手術組，且隨時相點呈遞增趨勢[13]。我們在既往的實驗研究中也發現，通過對先天性腦損傷仔鼠進行早期觸摸、豐富環境刺激和運動訓練，干預組仔鼠腦組織BDNF陽性表達明顯高于非干預組和對照組仔鼠，并且干預組仔鼠腦白質神經髓鞘平均厚度高于非干預組，提示豐富康復訓練對中樞神經髓鞘的發育和修復具有積極作用[14]。

基于上述理論及研究成果，本實驗采用宮內感染所致先天性腦損傷仔鼠動物模型，將電針干預與豐富康復訓練有機結合起來，形成綜合干預手段，觀察仔鼠腦皮質BDNF的表達情況，實驗結果顯示，干預組仔鼠BDNF陽性表達明顯高于對照組和非干預組仔鼠。目前，電針和豐富康復訓練均早已是神經系統疾病康復的常規治療手段，重要性不言而喻。本實驗雖僅從腦皮質BDNF表達的角度觀察和探討電針聯合豐富康復訓練對先天性腦損傷的治療意義，但考慮到BDNF對中樞神經系統的發育、修復、再生方面的重要作用，進一步證實了電針聯合豐富康復訓練對腦損傷有著積極的治療價值，為小兒腦損傷治療的臨床早期運用提供了重要的實驗依據。

[1]周子恩,丁文龍.腦源性神經營養因子及其在中樞神經損傷修復中的作用[J].解剖科學進展,2009,15(3):324-328.

[2]Pencea V,Bingaman KD,Wiegand SJ,et al.Infusion of brain-derived neurotrophic factor into the lateral ventricle of the adult rat leads to new neurons in the parenchyma of the striatum,septum，thalamus,and hypotha1amus[J].J Neurosci,2001,21(17):6706-6717.

[3]徐曉曉,周江堡.BDNF對新生鼠缺血缺氧性腦損傷的保護作用的研究[J].重慶醫科大學學報,2010,35(11):1642-1645.

[4]Kim MW,Bang MS,Han TR,et al,Exercise increased BDNF and TrkB in the contralateral hemisphere of the ischemic rat brain[J],Brain Res,2005,1052(1):16-21.

[5]張三明,魯翔.BDNF在局部腦缺血大鼠的表達[J].江蘇醫藥,2008,34(l0):1032-1033.

[6]王占堯,曹磊,姬西團.bFGF和BDNF對小鼠神經干細胞體外增殖分化的影響[J].中華神經外科疾病研究雜志,2010,9(5):435-437.

[7]寧曉霞,師社會,胡海濤,等.腦源性神經營養因子及其受體TrkB在大鼠新皮質的表達研究[J].陜西醫學雜志,2007,36(9):1122-1124.

[8]張迪,孫陽,王麗芹.電針百會、風府穴對學習記憶障礙大鼠的認知行為及腦內BDNF的影響[J].中醫藥學報,2011,39(3):113-115.

[9]王彥春,梁少榮,馬駿,等.電針對局灶性腦缺血模型大鼠皮層BDNF、TrkB的影響[J].中華中醫藥學刊,2012,30(3):358-360.

[10]張向飛,鄒宇,趙婭,等.督脈電針刺激對脊髓全橫斷小鼠大腦皮質運動區BDNF表達的影響[J].四川大學學報(醫學版),2012,43(2):250-253.

[11]鄒偉,劉芳,孫曉偉.頭針對急性腦出血大鼠BDNF和NGF表達的影響[J].中醫藥學報,2010,38(6):14-16.

[12]王哲,王守巖,王德山,等.眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織BDNF表達影響[J].針灸臨床雜志,2011,27(7):57-60.

[13]李紅玲,王馬魁,任力,等.運動訓練對大鼠出血性腦損傷BDNF基因及其蛋白表達的影響[J].中國康復醫學雜志,2008,23(9):782-785.

[14]王風波,李曉捷,唐明薇.豐富康復訓練對先天性腦損傷仔鼠腦神經髓鞘發育和修復的影響[J].中國傷殘醫學雜志,2011,19(9):6-9.