斜臥青霉去泛素化蛋白酶CREB的缺失提高纖維素酶的生產

周廣麒，呂晶，李忠海，李晶晶，王明鈺，曲音波，肖林，覃樹林，趙海濤，夏蕊蕊，方詡

1 大連工業大學生物工程學院，遼寧 大連 116034

2 山東大學微生物技術國家重點實驗室，山東 濟南 250100

3 山東大學藥學院，山東 濟南 250012

4 山東龍力生物科技股份有限公司，山東 德州 251200

5 山東省秸稈生物煉制技術企業重點實驗室，山東 德州 251200

木質纖維素是自然界中分布最為廣泛的可再生資源。利用木質纖維素生產潔凈的生物能源是將來解決石化產品污染的重要舉措。絲狀真菌能產生多種纖維素酶和半纖維素酶并有效降解木質纖維素生成多用途糖類。斜臥青霉Penicillium decumbens T.[1-3]作為重要的高產纖維素酶絲狀真菌之一，已應用于纖維素酶及半纖維素酶的工業生產，但對于高效低成本地降解利用木質纖維素，還需要對該菌株的多種代謝途徑進行系統的菌株改造。

微生物細胞中，碳源代謝阻遏作為重要的生理代謝控制機制使細胞在較容易利用的碳源存在時，相比其他較難代謝的碳源具有優先利用的特點。絲狀真菌中參與碳源代謝阻遏的蛋白主要有CREA (CRE1)[4]、CREB[5]、CREC[6]及CRED[7]。CREA 與釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae H.中的 Mig1/Mig2/Mig3蛋白同源[8]，為重要的轉錄調控因子，介導葡萄糖在碳源代謝阻遏中的作用[9]，同時，CREA蛋白可與泛素結合，形成泛素化蛋白[7]。泛素化的CREA相對不穩定，容易受到蛋白酶的降解。CREB和CREC分別編碼1個去泛素化蛋白酶[5]，在多核真核細胞中較為普遍，但在單核細胞釀酒酵母中未發現同源蛋白的存在。在構巢曲霉Aspergillus nidulans W.中，creB基因編碼1個由767個氨基酸，包括6個去泛素化結構域組成的去泛素化酶，屬于泛素特異性加工酶 (Ubiquitin-specific processing enzymes，UBP) 家族中的一員，其中的卷曲螺旋結構域起到底物識別的作用[9]。CreB是第1個被發現參與碳代謝阻遏作用的去泛素化酶，CreB在第 240位、385位、473位和538位的氨基酸有4個重要的PEST序列，PEST序列是一段富含脯氨酸(P)、谷氨酰胺 (E)、絲氨酸 (S)、蘇氨酸 (T)，約由 10個氨基酸組成的結構序列，被認為是泛素化識別序列之一[10]。CreB的同源序列大部分存在比較高等的生物中，比如人類的UBH1，擬南芥的UBP3，畢赤酵母Pichia pastoris Yeast C.中的UBP1以及黑腹果蠅的AAF56066。在構巢曲霉中 CREB的缺失可以引起多種纖維素酶的產量提高[5]，Denton等在里氏木霉 Trichoderma reesei中敲除creB的同源序列cre2，同樣可以達到提高纖維素酶產量的作用[11]。CREB和CREC可形成去泛素化復合體，共同作用于泛素化的蛋白質并使其去泛素化，從而使去泛素化的蛋白質更為穩定[6]。CRED包含1個抑制蛋白結構域和1個PY模塊與釀酒酵母中的Rod1p和Rog3p蛋白具有高度的相似性，creD參與 1個與CREB-CREC復合物的去泛素化作用完全相反的過程，可以對靶蛋白進行泛素化標記[7]。由于蛋白質 (如 CREA) 泛素化水平的增高會造成該蛋白在細胞中受降解程度的變化，進而影響到細胞利用碳源的代謝途徑，因此，CREB的缺失對真菌利用纖維素作為碳源分泌纖維素酶的影響值得深入研究。

通過敲除與構巢曲霉creB基因同源的基因，獲得了該基因的突變株，研究CREB在斜臥青霉利用纖維素時對產纖維素酶的影響，對該突變株的表型，產纖維素酶及產胞外蛋白的能力進行了測定和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

斜臥青霉Ku-39 (Δpku70::hph)、菌株Kup-1 (Δpku70::hph；ΔpyrG::ptrA) 以及質粒 pEKU由山東大學微生物技術國家重點實驗室保存，pMD18-T載體購自 TaKaRa公司，大腸桿菌DH5α感受態細胞購自TransGen Biotech公司。

1.1.2 培養基

麩皮培養基：100 g麩皮加 1 L水，煮沸30 min，過濾后定容至1 L。固體麩皮培養基加2%瓊脂粉。LB培養基和測生物量液體培養基分別參照文獻[12]和[13]。表型分析培養基：Mandel′s營養鹽液 (1倍)，1‰ Triton-100，2%瓊脂粉，碳源分別為2%葡萄糖，1%微晶纖維素，1%葡萄糖+1%微晶纖維素，2%可溶性淀粉，pH 5.5。測酶活培養基：Mandel′s 營養鹽液(1倍)，1%微晶纖維素，pH 5.5。

1.1.3 主要試劑

Taq、FastPfu DNA 聚合酶購自 TransGen Biotech公司、限制性內切酶購自Fermentas公司，瓊脂糖凝膠/PCR產物純化試劑盒購自 Biomiga公司，細胞壁裂解酶 (L1412-25G) 購自 Sigma公司，改良型Bradford法蛋白質濃度測定試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司，Southern雜交試劑盒購自羅氏診斷產品 (上海)有限公司，pMD18-T載體購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 斜臥青霉分子生物學操作方法

質粒提取：堿裂解法[12]，將帶有質粒的大腸桿菌培養14 h，離心，倒掉上清液，加入溶液Ⅰ(GET) 充分懸浮菌體，再加入溶液Ⅱ (變性液)，加蓋顛倒6~7次充分混勻，加入溶液Ⅲ顛倒混合均勻后冰上放置 5 min，離心將上清液轉移到1.5 mL離心管中，利用醇沉的方法得到沉淀，用適量雙蒸水溶解。

真菌轉化：斜臥青霉Kup-1的轉化通過細胞壁裂解酶消化細胞壁得到原生質體，再利用PEG-CaCl2法轉化目的DNA片段[13]。

染色體DNA提取：真菌染色體DNA的提取采用液氮研磨法[13]。接種濃度為1×107個/mL新鮮的分生孢子于液體培養基中，30 ℃、200 r/min培養48 h，將菌體過濾收集，放入研缽中加入液氮進行研磨破碎，收集破碎后的菌體于15 mL離心管中加入適量抽提緩沖液，65 ℃水浴，然后加入苯酚/氯仿振蕩充分混合均勻后，離心收集上清液，加入NaAc和異丙醇，?20 ℃放置20 min后離心收集沉淀物，用70%乙醇，洗滌1次，待乙醇完全揮發后加入雙蒸水溶解。

1.2.2 轉化子表型分析

分別吸取1 μL濃度為1×105個/mL的孢子懸液，點接于表型分析培養基平板，30 ℃ 靜置培養9 d。

1.2.3 蛋白質含量測定

參考改良型 Bradford法蛋白質濃度測定試劑盒說明。

1.2.4 生物量測定

接 1×107個/mL分生孢子懸液 100 μL至50 mL液體基本培養基中，30 ℃、200 r/min 培養，分別在24、33、42、51、60、69 h時取樣，真空過濾抽干，80 ℃烘干24 h，稱重。

1.2.5 濾紙酶活、木聚糖酶活、內切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活力的測定

濾紙酶活：1 cm×6 cm定量濾紙條，1 mL醋酸緩沖液 (pH 4.8) 和0.5 mL稀釋后的粗酶液，50 ℃酶解1 h。

木聚糖酶活：1 mL 1%的燕麥木聚糖懸浮液，0.5 mL稀釋后的酶液，50 ℃酶解30 min。

內切葡聚糖酶活：1 mL 1%的CMC-Na溶液，0.5 mL稀釋后的酶液，50 ℃酶解30 min。

以上3種酶活測定中，均以DNS法測定酶解液中的還原糖量。

外切葡聚糖酶活：0.5 mL稀釋后的粗酶液，加入50 μL pNPC (g/L)，50 ℃保溫30 min；加入150 μL 10% NaCO3終止反應[14]。

酶活力單位：1分鐘內水解底物產生1 μmol還原糖或對硝基苯酚所需的酶量定義為1個酶活力單位 (IU)。

1.2.6 pH測定

取 1 mL產酶發酵液，12 000 r/min離心3 min，吸取上清液，測pH值。

1.2.7 ΔcreB::pyrG敲除盒的構建

ΔcreB::pyrG 敲除盒的構建 (圖 1)。ΔcreB::pyrG敲除盒上、下游同源臂 (5′-flanking，3′-flanking) 以及上游同源臂部分重復序列(5′-flanking RE) 的擴增均以Ku-39染色體DNA為模板，分別以引物對 CreB-uF+CreB-uR；CreB-dF+CreB-dR1和CreB-reF+CreB-reR為引物(表1)。pyrG篩選標記表達盒的擴增以質粒pEKU (山東大學微生物技術國家重點實驗室保存) 為模板，PyrG-F1和PyrG-F2為引物。ΔcreB::pyrG敲除盒下游 3個片段的連接采用 Double-joint PCR[15]方法，融合 pyrG 篩選標記表達盒、ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂部分重復序列以及下游同源臂 3個片段，再以 PyrG-F2和CreB-dR2為嵌套引物，PCR擴增獲得融合產物，并將該融合產物經瓊脂糖凝膠純化回收后經T/A連接插入到克隆載體pMD18-T上，獲得重組質粒pCreB-DT，轉化DH5α感受態細胞。將質粒pCreB-DT和ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂分別進行XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切，然后通過T4 DNA連接酶進行連接，獲得重組質粒 pCreBqch，帶有上游部分同源臂序列的ΔcreB::pyrG 敲除盒構建成功。將重組質粒pCreBqch轉化DH5α感受態細胞。以質粒 pCreBqch為模板，CreB-uF和CreB-dR2為引物PCR大量擴增ΔcreB::pyrG敲除盒，轉化斜臥青霉Kup-1原生質體。

圖1 ΔcreB::pyrG敲除盒構建流程圖Fig. 1 Flow diagram of ΔcreB::pyrG.

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

Double-joint PCR反應體系：第1輪PCR， 50 μL反應體系為：40 μL雙蒸水，上下游引物各1 μL，dNTPs (10 mmol) 1 μL，模板1 μL，10×緩沖液5 μL，Taq DNA聚合酶1 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃, 20 s；58 ℃, 30 s；72 ℃, 1 min 30 s，32個循環；72 ℃延伸10 min。分別切膠回收3個第1輪PCR產物：上游同源臂、下游同源臂以及上游同源臂部分重復序列，來進行第2輪PCR，本輪PCR不需要添加引物，反應體系為：40 μL雙蒸水，dNTPs (10 mmol) 1 μL，3個DNA片段各1 μL，10×緩沖液5 μL，HIFI酶1 μL。反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃, 20 s； 55 ℃, 10 min；72 ℃, 4 min，12個循環；72 ℃延伸10 min。將第2輪PCR產物適當稀釋作為第3輪PCR的模板；40 μL雙蒸水，dNTPs (10 mmol) 1 μL，10×緩沖液5 μL，HIFI酶1 μL。反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃, 20 s；55 ℃, 30 s；72 ℃, 5 min，32個循環；72 ℃延伸10 min。

斜臥青霉creB基因序列已提交 GenBank，登錄號為JN977580。

1.2.8 系統進化樹分析

根據斜臥青霉中 CreB氨基酸序列，自NCBI (National Center for Biotechnology Information)數據庫比對篩選出該蛋白在絲狀真菌中的同源序列。CreB同源序列分別來自產黃青霉Penicillium chrysogenum T.、構巢曲霉A. nidulan、煙曲霉Aspergillus fumigates、黑曲霉Aspergillus niger、米曲霉 Aspergillus oryzae、Talaromyces stipitatus、馬爾尼菲青霉菌Penicillium marneffei、里氏木霉 T. reesei、粗糙脈孢菌 Neurospora crassa。鄰接系統發育樹 (Neighbor Joining tree)采用軟件包ClustalX 2.0和MEGA4.1分析構建，標尺為每位點氨基酸替代值。

2 結果與分析

2.1 ΔcreB::pyrG敲除盒的構建

為得到 creB基因缺失突變株，首先構建了ΔcreB::pyrG 敲除盒。首先，分別擴增得到了ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂序列1 476 bp、pyrG篩選標記表達盒1 538 bp、ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂部分重復序列 531 bp以及ΔcreB::pyrG敲除盒下游同源臂序列 1 733 bp (圖2泳道1–4)。采用Double-joint PCR[15]的方法將pyrG篩選標記表達盒、ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂部分重復序列以及ΔcreB::pyrG敲除盒下游同源臂，3個片段融合，嵌套引物PyrG-F2+ CreB-dR2擴增得到3片段融合產物 (圖2泳道5)，然后將該融合片段連接到pMD18-T載體上，得到重組質粒 pCreB-DT (圖 2泳道 6)。將質粒pCreB-DT和 ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂(圖2泳道6, 1) 分別進行XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切，酶切產物經切膠回收后通過 T4 DNA連接酶連接，得到重組質粒 pCreBqch (圖 2泳道9)。以pCreBqch為模板，CreB-uF和CreB-dR2為引物擴增ΔcreB::pyrG敲除盒 (圖2泳道13)。Hind Ⅲ和KpnⅠ分別單酶切驗證ΔcreB::pyrG敲除盒，經Hind Ⅲ酶切后電泳結果顯示得到3條帶大小分別為725 bp、1 185 bp以及2 819 bp (圖2泳道14)，KpnⅠ酶切后電泳結果顯示得到3條帶大小分別為482 bp、1 927 bp以及2 320 bp (圖2泳道15)，2個酶切結果均與預期目的條帶大小一致，表明ΔcreB::pyrG敲除盒構建成功。

重組質粒 pCreB-DT由華大基因進行測序驗證。

圖2 ΔcreB::pyrG敲除盒的構建以及酶切驗證Fig. 2 Construction of creB gene deletion cassette and the confirmation of the cassette structure by restriction enzyme digestion. 1: 5'-flanking region of creB gene in the deletion cassette; 2: pyrG; 3: Partial repeating sequence of the 5'-flanking region of creB gene in the deletion cassette; 4: 3'-flanking region of creB gene in the deletion cassette; 5: the fused cassette of 2,3,4 using nest PCR; 6: pCreB-DT vector; 7: amplification of the fused cassette of 2,3,4 using nest PCR from 6; 8: pCreB-DT vector digested with Hind Ⅲ; 9: pCreBqch; 10: colony PCR confirmation of pCreBqch; 11: 10 digested by EcoR I; 12: 10 digested by Kpn I; 13: the creB gene deletion cassette; 14: 13 digested by Hind III; 15: 13 digested by Kpn I.

2.2 ΔcreB突變株的構建

將構建成功的 ΔcreB::pyrG 敲除盒轉入Kup-1菌株中。在轉化平板上獲取轉化子10~15個/μg DNA。為排除轉化子中的異核體，挑取轉化子在平板上經過2輪劃線分單孢復篩培養。將純化后的轉化子接入到基本培養基中，30 ℃、200 r/min搖床培養 48 h。提取轉化子基因組DNA。以提取的基因組 DNA為模板，PyrG-F2和PyrG-R為引物擴增pyrG表達盒部分序列，(圖3，泳道1–2)，擴增出大小為1 345 bp的目的條帶，表明 ΔcreB::pyrG敲除盒已成功轉入到出發菌株中。CreB-YZF1和CreB-YZR1 (序列見表 1) 為引物，其中引物 CreB-YZF1和CreB-YZR1結合位點分別位于ΔcreB::pyrG敲除盒上游同源臂和下游同源臂，分別以出發菌株及轉化子基因組DNA為模板，出發菌株擴增獲得3 573 bp大小目的條帶 (圖3，泳道3)，而轉化子擴增出片段大小為 2 652 bp大小目的條帶(圖 3，泳道 4–5)，表明 ΔcreB::pyrG敲除盒在creB基因位點發生同源雙交換，creB基因編碼區已被置換；為進一步驗證creB基因已被同源敲除，以PyrG-YF和CreB-dR1為引物，分別以出發菌株及2株不同轉化子基因組DNA為模板，進行PCR擴增。其中引物PyrG-YF和CreB-dR1的結合位點分別位于 pyrG基因編碼區和ΔcreB::pyrG 敲除盒下游同源臂外側的染色體上。由于出發菌株不能擴增出相應大小的目的條帶 (圖3，泳道6)，而以2株轉化子DNA為模板，上下游引物可配對擴增出大小為2 515 bp的目的條帶 (圖3，泳道7–8) 說明2株轉化子發生同源雙交換。以上結果表明，ΔcreB突變株已構建成功。

2.3 ΔcreB突變株的Southern blotting分析

圖3 ΔcreB轉化子的PCR驗證Fig. 3 Verification of transformants by PCR analysis. 1–2: amplification of pyrG gene with genomic DNA of the transformants; 4–5, 7–8: amplification was performed with genomic DNA of the primary transormants; 3, 6: amplification was performed with genomic DNA of ΔpyrG::ptrA.

為分析ΔcreB::pyrG敲除盒在轉化子染色體中的整合類型，對得到的轉化子進行 Southern blotting (圖 4A) 檢測，首先分別提取出發菌株Kup-1及 ΔcreB::pyrG 敲除盒轉化子基因組DNA，然后經限制性內切酶 BamHⅠ酶切，ΔcreB::pyrG敲除盒下游同源臂 DNA片段為探針進行 Southern雜交 (圖 4B)。雜交結果顯示ΔcreB突變株出現單1條帶 (圖4A，泳道1)，該條帶大小符合 ΔcreB::pyrG敲除盒在 creB位點以同源雙交換整合方式所產生雜交片段的大小，并未出現出發菌株雜交所示條帶 (圖 4A WT)。由于ΔcreB突變株未出現因敲除盒的隨機插入而產生的條帶，因此，雜交結果表明ΔcreB::pyrG敲除盒是以單拷貝的形式整合到轉化子染色體上。

2.4 ΔcreB突變株的表型分析

為分析creB基因缺失對該菌株表型的影響，吸取ΔcreB突變株及菌株Ku-39分生孢子懸液，分別點接于葡萄糖、微晶纖維素、葡萄糖+微晶纖維素以及可溶性淀粉為碳源的平板。在以葡萄糖為唯一碳源的基本培養基上，ΔcreB突變株的菌落形態以及生長速率相比菌株 Ku-39均未發生明顯變化 (圖5A)，表明creB基因的缺失對菌株的營養生長未產生明顯的影響。在以可溶性淀粉為唯一碳源的平板上，ΔcreB突變株的菌落生長表型相比Ku-39菌株也無明顯變化，但平板經碘化鉀染色后 (圖 5D)，突變株所形成的淀粉水解圈變大，表明ΔcreB突變株分泌淀粉酶的活性增強。在以微晶纖維素為唯一碳源的培養基上(圖5B)，ΔcreB突變株生長正常，與對照菌株相比無明顯差異，但在菌株ΔcreB菌落周圍出現明顯的因纖維素降解所形成的透明圈，而菌株Ku-39菌落周圍未出現纖維素水解透明圈，表明creB基因的缺失可提高突變株產纖維素酶的活性，特別在葡萄糖存在的培養條件下，以微晶纖維素+葡萄糖為復合碳源的培養基上 (圖 5C)，ΔcreB突變株仍能形成較為明顯的纖維素水解透明圈，表明 creB基因的缺失不僅能提高產纖維素酶的能力，而且還呈現出一定的抗葡萄糖代謝阻遏效應。

圖4 斜臥青霉Kup-1 creB敲除Southern blotting分析Fig. 4 Southern blotting analysis of the P. decumbens Kup-1 ΔcreB knockout strain. (A) Southern blotting analysis of the knockout strain. M: 1 kb ladder. WT: Southern blotting of genomic DNA extracted from wild-type. 1: Southern blotting of genomic DNA extracted from the knockout strain. (B) Diagram of creB deletion by homologous recombination.

圖5 ΔcreB突變株的平板檢測分析Fig. 5 Comparing the morphologies of ΔcreB and the Ku-39 strain cultivated for 9 days. (A) Glucose. (B) Cellulose. (C) Glucose +Cellulose. (D) Starch.

2.5 pH值的變化

為測定 CREB的缺失對菌株在液體培養條件下發酵的影響，對菌株Ku-39和ΔcreB突變株不同培養時間段發酵液的 pH值進行了測定(圖6)。ΔcreB突變株和Ku-39菌株發酵液的pH值在48 h內均明顯處于下降的狀態，在24 h處，ΔcreB突變株發酵液的pH值下降速度明顯慢于出發菌株。Ku-39菌株和ΔcreB突變株發酵液的pH值48 h前后分別達到最低點3.6和3.5，并在48 h與120 h之間發酵液pH值穩步上升達到5.2左右，隨后 pH值趨于穩定，結果表明，CREB的缺失對突變株在以微晶纖維素為唯一碳源的發酵液pH值沒有明顯變化。

圖6 菌株Ku-39和ΔcreB突變株發酵過程的pH值Fig. 6 pH value of P. decumbens Ku-39 and ΔcreB.

2.6 酶活力的變化

在液體培養產酶條件下，對菌株 Ku-39和ΔcreB突變株不同培養時間段發酵液的濾紙酶活、內切葡聚糖酶活、木聚糖酶活、外切葡聚糖酶活進行了測定 (圖7)。ΔcreB突變株發酵液的濾紙酶活、內切葡聚糖酶活、木聚糖酶活、外切葡聚糖酶活均比出發菌株的相應酶活顯著提高，其中，ΔcreB突變株發酵液的濾紙酶活在第144 h時，比Ku-39菌株發酵液提高了1.8倍 (圖7A)，內切葡聚糖酶活在96 h比出發菌株提高1.71倍(圖 7B)，木聚糖酶活在 120 h時提高 2.06倍(圖7C)，外切葡聚糖酶活在96 h時提高2.04倍(圖7D)。ΔcreB突變株纖維素酶活的提高與在固體纖維素平板上該突變株的表型一致，均表現出纖維素酶分泌活性的顯著增加，由此表明，CREB的缺失可顯著增強突變株產纖維素酶的能力，進而提高菌株降解利用纖維素的效能。

2.7 分泌蛋白質總量變化

圖7 菌株Ku-39和ΔcreB突變株的濾紙酶活、內切葡聚糖酶活、木聚糖酶活、外切葡聚糖酶活Fig. 7 Filter paper activity, endoglucanase activity, xylanase activity and exoglucanase activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB. (A) Production of filter paper activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB. (B) Production of endoglucanase activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB. (C) Production of xylanase activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB. (D) Production of exoglucanase activity by P. decumbens Ku-39 and ΔcreB.

圖8 菌株Ku-39和ΔcreB突變株的分泌蛋白質含量Fig. 8 Concentration of secreted protein of P. decumbens Ku-39 and ΔcreB during the fermentation.

在液體培養產酶條件下，對菌株 Ku-39和ΔcreB突變株不同培養時間段發酵上清液蛋白質含量進行了測定 (圖8)。在培養至24 h時，ΔcreB突變株與菌株 Ku-39發酵液的蛋白質含量均比較低，自培養24 h開始，ΔcreB突變株發酵上清液中的蛋白質含量相比對照菌株明顯提高，其中在72 h、96 h、120 h、144 h以及168 h時，其蛋白質含量分別達到菌株 Ku-39的 1.93倍、2.68倍、2.00倍、2.30倍以及1.31倍，胞外蛋白質濃度總體呈明顯的上升趨勢。因此，creB基因的缺失可導致細胞外蛋白質含量的顯著增加。

2.8 生物量變化

為測定 creB基因的缺失是否影響菌株的營養生長，接濃度為1×107個/mL的分生孢子到液體基本培養基中。ΔcreB突變株和菌株Ku-39在培養24 h后，進入了對數生長期，并且在48 h左右達到菌體的最大量。在培養48 h后，ΔcreB突變株生物量進入生長穩定的平臺期，生物量相比菌株Ku-39略低。在液體培養條件下，creB 基因的缺失可輕度影響突變株的營養生長 (圖9)。

圖9 菌株Ku-39和ΔcreB突變株的生長量Fig. 9 Growth of P. decumbens Ku-39 and ΔcreB in glucose-based medium.

2.9 CREB在絲狀真菌中的系統進化

從CreB系統進化樹 (圖10) 可以發現，CreB存在于許多產纖維素酶絲狀真菌中，并且其氨基酸序列與產黃青霉以及曲霉屬來源的CreB同源序列有較高的相似度。因此可以推測CreB在絲狀真菌纖維素酶合成過程中具有重要的作用。

圖10 CreB系統進化樹Fig. 10 The neighbor joining tree of CreB. Deubiquitinating enzyme CreB are highly conserved across most sequenced filamentous fungi. The neighbor joining tree above shows the phylogenetic relationship of some of the fungal CreB in the NCBI protein database and their relationship to P. decumbens CreB. The bootstrap values are shown and the The bar=0.05 represents genetic distance in substitutions per amino acid.

3 討論

通過同源雙交換整合的方式在斜臥青霉中敲除 creB基因，獲得了產纖維素酶和胞外蛋白質含量均提高的突變株ΔcreB。creB基因編碼1種去蛋白質泛素化酶[5]，因此，開展微生物蛋白質的泛素化與去泛素化的研究對于菌株的改造具有重要的意義。

真菌遺傳轉化系統中可利用的篩選標記比較有限。現在較為常用的篩選標記主要有ptra[16]、hph[17]、Hyg[18]、pyrG[19]和amdS[20]等，但工業菌株的系統改造需要在同一株菌中進行多次的遺傳操作，因此，需要在斜臥青霉中通過構建可重復利用的篩選標記操作系統，用于該菌累積式的系統改造。在斜臥青霉中已經構建了高效的遺傳基因打靶系統菌株Ku-39[21]，并在此基礎上獲取了 pyrG缺失突變株 Kup-1 (數據未發表)。在構建creB敲除盒的過程中，在該敲除盒的pyrG表達盒兩側加入同源臂部分重復序列。由于該菌株具有高效的同源重組效率，因此，在含有 5′-氟乳清酸 (5′-FOA) 的平板上可高效篩選pyrG篩選標記自我剪切的菌株。篩選標記重復利用系統的建立為該菌株代謝途徑的優化重組，進而為構建高產纖維素酶菌株提供了良好的基因操作基礎。

蛋白質的泛素化可導致蛋白質的降解和影響蛋白質的活性。ΔcreB突變株也可在含有葡萄糖的纖維素平板上形成透明圈，表明該突變株在葡萄糖存在的情況下仍有較強的纖維素酶活性。在絲狀真菌降解利用纖維素等過程中，如存在較容易利用的碳源，則可抑制纖維素酶的產生，從而產生碳源代謝阻遏效應。負責碳源代謝阻遏的蛋白主要有 CREA[4]、CREB[5]、CREC[6]及CRED[7]。CREA作為1種重要的轉錄調控因子，可通過影響其他調控因子如 XlnR[22-23]，間接調控木聚糖的利用，并且，CREA的缺失可造成明顯的抗代謝物阻遏作用。CREB和CREC分別編碼1種去蛋白質泛素化的蛋白，這2種蛋白的結合可形成具有去蛋白質泛素化功能的復合物[6]，該復合物可與泛素化后的 CREA相結合并使其去泛素化，進而增強CREA的穩定性，而CREB的缺失則造成CREC和CREB不能形成有效的去泛素化復合物，從而導致泛素化后的CREA蛋白不穩定，容易受到蛋白酶的降解，進而減少葡萄糖代謝的阻遏效應，同樣，在缺失CREC蛋白的情況下，也可產生與 CREB缺失相類似的現象(數據未發表)。因此，開展對蛋白質的降解機理的研究對于提高菌株蛋白質的產量，特別是針對菌株高產工業用酶的研究具有較強的指導作用。

碳源代謝阻遏調控機制的存在，使細胞能優先利用營養價值較高的碳源作為細胞的能源，特別是在葡萄糖等較易利用碳源存在條件下，可顯著降低纖維素酶的產量。絲狀真菌中纖維素酶的表達轉錄明顯受轉錄因子 CREA/CRE1[24-26]、XLNR/XYR1[27-29]、ACE1、ACE2[24]等的調控，其中CREA/CRE1是細胞產生碳源代謝阻遏過程中特別重要的調控中間體。在里氏木霉[25]、斜臥青霉[13]等絲狀真菌中，CREA/CRE1的缺失造成纖維素酶表達過程中碳源代謝阻遏現象的降低或消除，并使相應突變株中纖維素酶表達量明顯提高。里氏木霉中，XYR1和ACE1分別作為纖維素酶表達重要的正向和負向轉錄調控因子，CRE1的完全缺失明顯降低XYR1的轉錄活性，并且導致ACE1的表達顯著提高，表明ACE1也受到了明顯的碳源代謝阻遏效應[25]。里氏木霉中ACE2可正向調控纖維素酶的表達。CRE1蛋白的完全缺失可導致ACE2表達量顯著降低[25]，然而在構巢曲霉、斜臥青霉和黑曲霉中，未發現與ACE2同源的調控蛋白，表明絲狀真菌纖維素酶系的表達調控存在較大區別。由于CREA/CRE1的穩定性受細胞蛋白質泛素化/去泛素化機制的明顯影響，因此，深入研究絲狀真菌重要蛋白質泛素化的機制對于消除或降低纖維素酶表達的碳源代謝阻遏效應有重要的作用。

提高絲狀真菌產纖維素酶的活性一直是重要的研究領域。通過缺失去蛋白質泛素化蛋白CREB，獲得產纖維素酶活性提高的ΔcreB突變株，該突變株不僅能顯著提高菌株的濾紙酶活，而且對纖維素內切酶、外切酶、木聚糖酶活均有明顯的提高作用，表明CREB很可能也作用于其他 (除CREA之外) 與纖維素酶基因表達調控相關的轉錄調控因子，并影響到其穩定性。而且，通過圖 10的 CreB系統進化樹發現斜臥青霉CreB與產黃青霉以及曲霉屬的較為相近。在產纖維素酶絲狀真菌中，纖維素酶的調控受到多種轉錄調控因子的作用，如 ACE1[30]、ACE2[30]、CREA[4]、XLNR[22-23]以及其他新發現的轉錄調控因子 (數據未發表)，因此，對轉錄調控因子穩定性的改造作為1種重要的細胞調控機制對于產酶菌株生產改造具有重要的意義。

由于絲狀真菌具有較強的蛋白分泌能力，已成為重要的表達生產內、外源蛋白“細胞工廠”之一。然而由于絲狀真菌較強的蛋白酶活性，表達分泌到細胞外的外源蛋白產量仍處于較低水平。CREB的缺失可使突變株分泌胞外蛋白的含量提高2.68倍。細胞外蛋白質含量的增加，有可能由于 creB基因的缺失造成蛋白酶的泛素化，進而造成泛素化的蛋白酶的快速降解，從而間接提高了蛋白分泌到細胞外的含量。因此，深入開展蛋白質的改造對于提高內、外源蛋白的高效表達并提高其穩定性具有重要的作用。

通過同源雙交換整合的方式首次在青霉中敲除了編碼去蛋白質泛素化的基因creB，該基因的敲除未對菌株的表型產生明顯的影響，但可顯著提高突變株的纖維素降解利用能力，并且明顯增加胞外蛋白質的含量。斜臥青霉作為重要的產纖維素酶工業生產菌株，其基因組序列已測序完成，因此，利用基因工程手段并結合組學的研究方法對菌株的代謝途徑進行系統改造已成為構建高效工業生產菌株重要的創造平臺。

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