鑒別杰多霉素生物合成后修飾氧化酶JadH中參與底物結合或催化的關鍵殘基

彭曉靜，季俊杰，張霞，范可強，金玲，張玉秀，楊克遷

1 中國礦業大學 (北京) 化學與環境工程學院，北京 100083

2 中國科學院微生物研究所 微生物資源前期開發國家重點實驗室，北京 100101

角蒽環類聚酮抗生素是土壤中鏈霉菌產生的一類特殊的芳香聚酮化合物，具有化學結構和生理功能多樣性。與其他芳香聚酮化合物一樣，角蒽環類聚酮由Ⅱ型聚酮合酶 (Polyketide synthase，PKS) 催化合成。最小PKS (聚酮合酶α、聚酮合酶b、酰基載體蛋白) 催化短鏈羧酸連續脫羧聚合，形成聚酮碳鏈骨架[1]，然后經過聚酮還原酶、環化/芳化酶等形成一個常見的角蒽環類中間產物UWM6[2]。隨后的聚酮后修飾作用，如氧化還原、甲基化、糖基化等，對終產物的結構多樣性起決定性作用，同時引入的基團也對產物的生物活性產生重要的影響。因此，通過對聚酮后修飾酶的研究，闡明后修飾作用的機理，應用于合成生物學中，將有助于理性合成新的“非天然”的聚酮化合物。杰多霉素 (Jadomycin，JD)是委內瑞拉鏈霉菌 Streptomyces venezuelae ISP5230經熱激、乙醇處理或噬菌體感染產生的非典型角蒽環類抗生素[3-4]，具有抗革蘭氏陽性菌、酵母、及廣譜的抗腫瘤活性[5-6]，有重要的應用價值。研究表明杰多霉素可以通過抑制極光激酶B的活性，引發細胞凋亡[6]，同時還有殺傷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[7]和造成 DNA損傷的活性[8]。

和其他角蒽環類聚酮化合物一樣，杰多霉素也是經過對UWM6的羥化、脫水、氧化、骨架重排和糖基化等后修飾作用得到。已有的研究表明，FAD依賴的單加氧酶 JadH催化中間產物2,3-dehydro-UWM6 (DHU) 的 C12位羥化和4a,12b位脫水反應，得到 CR1，后者在空氣中可以自發氧化生成另一個中間產物dehydrorabelomycin (DHR)，因此JadH是一個羥化/脫水雙功能酶[9]。氨基酸序列比對顯示，JadH與參與角蒽環聚酮合成的FAD和NADPH依賴的單加氧酶PgaE、CabE和UrdE等有高的序列一致性。JadH與PgaE同源性為59%。PgaE參與 gaudimycin生物合成過程中兩步連續的氧依賴的后修飾反應：中間產物DHU在C12和C12b位的羥化[10-11]。JadH、PgaE和CabE等與多種FAD依賴的芳香羥化酶 (FAD-dependent aromatic hydroxylases，FAH) 表現出一定的序列相似性，表明它們可能具有相同的反應機理。許多 FAD依賴的芳香羥化酶的結構和反應機制已經得到深入研究，其中存在著復雜的構象變化[12]。通過分析對羥基苯甲酸羥化酶 (p-hydroxybenzoate hydroxylase，PHBH) 的晶體結構 (1PBE) 和定點突變數據，推測在反應過程中，PHBH可能經歷 3種不同構象的轉化[13-14]：與底物結合的PHBH處于“in”構象；底物電離觸發酶的構象變化，轉為“out”構象，從而可以與NADPH結合并使FAD還原得到FADH2；釋放NADP＋后PHBH恢復“in”構象，FADH2被 O2氧化得到過氧化中間體，并進一步羥化底物對羥基苯甲酸，此時的“in”構象保證了活性中間體不與溶劑接觸而失活；隨后產物被釋放，酶轉為“open”構象，可以再次結合底物，開始下一輪循環。幾個關鍵氨基酸殘基的突變可以影響 PHBH的構象轉換，干擾酶催化過程，其中R220Q和A45V可以穩定“open”構象[15]，減緩底物結合速率；A45G可以穩定“in”構象[16]，阻斷反應過程。芳香羥化酶PgaE和CabE與PHBH的三維結構相似。P282S突變使PgaE活性提高[17]。JadH可能存在與PHBH和PgaE相似的反應歷程和構象變化。

本研究通過構建JadH結合底物DHU的三維結構模型和氨基酸序列比對，用定點突變和體外酶學催化實驗分析可能影響JadH活性的關鍵氨基酸，從而為進一步了解JadH結合底物的方式以及催化反應的機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

含jadFGHK基因的質粒pJV69A (+)、質粒pET30a (+)、E. coli BL21 (DE3) 菌株為本實驗室構建或保存。

1.1.2 酶和主要試劑

KOD_Plus DNA聚合酶購自TOYOBO公司。T4 DNA連接酶和 DNA限制性內切酶購自TaKaRa (Shiga，Japan) 公司。Ni-NTA Superflow購自GE公司。化學試劑FAD和NADPH均購自Sigma-Al-drich公司。PCR擴增引物和DNA測序由上海英駿生物技術有限公司完成。DHU、DHR和CR1均由本實驗室制備。

1.2 方法

DNA分子操作、感受態制備和轉化均遵循《分子克隆實驗指南》[18]。BLAST系列軟件(NCBI) 用來從數據庫中搜索相關基因或蛋白序列。多重序列比對利用Clustal X完成。蛋白的建模工作利用SWISS-MODEL Web服務器完成。蛋白三級結構的觀察和作圖利用 RasMol、Swiss-Pdb Viewer和MolMol完成。

1.2.1 JadH野生型表達載體的構建

天然序列的JadH和帶有His6標簽的JadH催化活性幾乎沒有差異，為了方便后續實驗蛋白的純化，構建表達載體pET30a-jadH-nHis，用來表達帶有His標簽的JadH蛋白。以pJV69A (+) 為模板，使用正向引物 (5￠-GTGGGTACC GTGAC CACCACCCCG-3￠) (下劃線表示KpnⅠ的酶切位點) 和反向引物 (5￠-GGAATTC ACCGGGCCGC GCCGC-3￠) (下劃線表示 EcoRⅠ的酶切位點)，PCR得到含有完整jadH基因的片段。用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切jadH片段和pET30a (+)。將酶切得到的載體和目的片段連接，連接產物轉化E. coli BL21 (DE3)，對得到的克隆進行DNA序列測序，篩選得到構建正確的pET30a-jadH-nHis。

1.2.2 JadH突變體表達質粒的構建

以構建好的野生型 JadH的表達載體pET30a-jadH-nHis為模板，設計均含有突變位點的、部分互補的突變引物進行PCR。在PCR產物中加入1 μL DpnI酶，37 ℃酶切1 h，酶切產物轉化E. coli BL21 (DE3)，對得到的克隆進行DNA序列測序，篩選得到構建正確的JadH突變體表達質粒。

1.2.3 JadH野生型和突變體的表達與純化

帶有野生型和突變型 JadH表達質粒的E. coli BL21 (DE3) 在含50 mg/L硫酸卡那霉素的Luria-Bertani (LB) 培養基中37 ℃、220 r/min培養至OD600為0.4~0.6，加入IPTG至0.5 mmol/L，16 ℃、220 r/min誘導表達10 h。離心收集菌體。重懸于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)，超聲破碎后離心取上清。按Ni-NTA Superflow說明純化JadH野生型及其突變體。將純化得到的蛋白于30 kDa的超濾管中脫鹽濃縮，重復3次。

1.2.4 蛋白濃度測定

蛋白濃度用Bradford法[19]測定。

1.2.5 體外酶學反應

將純化得到的酶 (0.2 mmol；JadH-N-His) 加到反應混合液中 (總體積為 200 μL，含有50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 8.0，4 μmol/L FAD，125 μmol/L NADPH和100 μmol/L DHU)，32 ℃反應60 s，加入1 μL 1 mol/L的HCl終止反應。HPLC檢測反應產物。

1.2.6 HPLC檢測分析

反應產物CR1和DHR的定量檢測使用C18反相HPLC (Shimadzu Prominence HPLC system)。洗脫速度為 1 mL/min，洗脫梯度為 25%乙腈+0.1%TFA到100%乙腈+0.1%TFA。底物DHU，產物CR1和DHR在266 nm和320 nm處檢測。

1.2.7 相對活性分析

由于JadH的真正催化產物CR1在酶促反應體系中會自發氧化轉化為 DHR，因此在計算JadH的催化活性時，要將產物DHR折合成CR1的量。根據對CR1自發氧化過程的HPLC分析，確定DHR與CR1的峰面積比值為1.4625∶1。因此可按下面公式計算折合產物量：

折合產物量=產物CR1峰面積+產物DHR峰面積/1.4625。

突變型JadH酶的相對活性根據折合產物量計算：

相對活性=突變體酶的折合產物量′100/野生型酶的折合產物量。

2 結果

2.1 JadH結構模型的構建和分析

以 CabE的晶體結構 (2QA1) 為模型構建JadH的三維結構模型，并使用PSI-Dock程序[20]構建JadH與DHU復合物的結構模型。結構模型分析顯示，底物DHU結合于JadH的一個疏水性口袋之中，并與R50、G51、L52、F100、R221、 I223、P295、G297、G298等殘基形成疏水作用和氫鍵，這可能是JadH與底物DHU識別和結合的結構基礎。氨基酸序列比對 (圖 1) 顯示，PHBH的R220、A45以及PgaE的P282在JadH中保守，分別為R221、G51和P295。推測，JadH中的這些位點也可能影響JadH的構象變化和催化作用。

2.2 野生型和突變型JadH的異源表達與純化

選擇JadH活性中心內的9個氨基酸 (R50、G51、L52、G53、F100、R221、I223、P295和G298)，構建了14個定點突變體 (表1)，測序篩選陽性克隆。在E. coli BL21 (DE3) 中異源表達野生型JadH及其突變體，確定JadH野生型及其突變株的蛋白表達條件，SDS-PAGE顯示所有JadH突變體均得到高效表達。JadH突變體蛋白用鎳離子親和層析純化，超濾脫鹽濃縮，SDS-PAGE顯示蛋白純度＞95% (圖2)。

2.3 HPLC測定JadH野生型及其突變體的相對活性

JadH是一個 FAD依賴的羥化/脫水雙功能酶，催化DHU C12位的羥化和4a,12b位的脫水，生成具有蒽酚結構的CR1，CR1在空氣中自發氧化成DHR[9]。由于CR1的自發氧化在酶促反應體系中無法避免，需要將生成的 DHR換算成CR1，合并計算確定JadH的活性。用HPLC檢測野生型及突變型JadH體外酶學反應的直接產物CR1以及CR1在空氣中自發氧化產物DHR的量，以野生型 JadH的催化活性為 100%，計算突變型 JadH的相對活性。結果顯示突變型JadH的活性均顯著低于野生型 (表1)。

圖2 純化后JadH及其突變體蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified wild type JadH and mutants. (A) 1: low molecular weight protein marker; 2: wild type JadH; 3: L52T; 4: L52K; 5: L52D; 6: G298K; 7: G298L; 8: G51V; 9: F100A; 10: wild type JadH. (B) 1: low molecular weight protein marker; 2: wild type JadH; 3: I223A; 4: R221Q; 5: R221L; 6: P295S; 7: G53D; 8: G53K; 9: R50L; 10: wild type JadH.

表1 JadH突變株的相對活性Table 1 The relative catalytic activities of JadH mutants

3 討論

迄今為止，還沒有關于JadH蛋白晶體結構的報道，我們依據JadH同源蛋白CabE的晶體結構構建了JadH及其與DHU復合物的結構模型(圖 3)。該結構模型與 CabE的晶體結構非常類似。通過分析結構模型并與其他羥化酶和氧化酶進行序列比較，推測JadH中9個氨基酸 (R50、 G51、L52、G53、F100、R221、I223、P295和G298) 可能參與底物識別、構象轉換或參與維持FAD所在區域內合適的疏水環境。我們通過定點突變得到JadH的突變體后進行體外酶學反應，通過HPLC檢測產物，以JadH野生型為對照，分析JadH突變體的相對活性，對這些殘基的功能進行了驗證。

圖3 JadH底物結合口袋內的關鍵氨基酸Fig. 3 The key residues in the substrate-binding pocket of JadH.

所得突變體的活性均遠低于野生型，其中L52T與 F100A 的相對活性分別為野生型的26.08%和14.65%；L52D、L52K、I223A、G298L和P295S突變體只有微弱的催化活性 (相對活性1%~5%)；G298K、R221L、R221Q和R50L均喪失了催化活性 (相對活性＜1%)。R50是一個帶正電荷的極性氨基酸，而 Leu為非極性氨基酸，極性的變化導致突變株R50L基本喪失催化活性。結構模型顯示，I223可與底物DHU形成疏水相互作用，當將其突變為Ala時，疏水作用減弱，而且鏈長改變導致空間位阻效應，因此I223A只有微弱的催化活性。殘基 L52和 P295可分別與底物DHU的A環和D環形成疏水相互作用，當突變為極性氨基酸Asp、Lys或Ser時，JadH與底物疏水作用減弱，識別、結合底物的能力降低，催化活性也隨之降低。另外，F100側鏈的苯環可能與底物DHU的C3位甲基形成較弱的疏水作用，Phe突變為Ala后，疏水作用減弱，影響底物的結合，導致活性較低。除疏水作用外，氫鍵也是酶與底物識別的重要結構基礎。結構模型顯示，G298主鏈上的氨基與底物的C4a位羥基可能形成很強的氫鍵，R221的側鏈末端胍基也可能與底物的C1位羰基氧形成氫鍵。當將Gly突變為具有較大側鏈的Leu或Lys時，產生較大的空間阻礙，干擾了氫鍵的形成，因此G298K喪失了催化活性，G298L也僅有微弱的活性 (2.27%)。而突變R221L和R221Q均同樣也會干擾R221側鏈胍基參與氫鍵的形成，進而影響到JadH的活性。同時，JadH的催化功能依賴FAD，推測脫水反應可能是由FAD傳遞質子的酸堿催化反應。疏水口袋的 FAD所在區域本身不帶電荷，將L52突變為帶正電的Lys或者帶負電荷的Asp后，會改變底物結合區域的靜電性質，可能干擾 FAD的質子傳遞過程，因此也會導致活性降低。同時，雖然Thr的疏水性比Leu弱，但是由于其帶有一個烷基側鏈，也可與底物形成疏水相互作用，因此L52T的相對活性高于L52D，為26.08%。

根據序列和結構特征，推測JadH應該具有和 FAD依賴的芳香羥化酶類似的反應機理和構象轉化過程。根據PHBH的研究結果以及序列比對信息推測，JadH的G51可能參與酶的構象轉化過程，G51突變成Val以后可穩定Open構象，減緩底物結合速率，從而降低酶的活性。G53距離底物的脫水位置和 FAD都比較近，將其突變成帶電的Lys和Asp，會改變底物區域的靜電性質，干擾 FAD在底物脫水過程中的質子傳遞過程，從而影響其活性，這與實驗結果一致。

但令人意外的是，突變體P295S的活性遠低于野生型酶，這與PgaE中對應的氨基酸P282的結果截然不同。在PgaE中將P282突變為Ser使PgaE活性提高，作者推測P282可能起到觸發和傳遞構象變化的關鍵作用，P282突變為Ser后構象變化的能壘減弱，有利于構象轉變[17]。在JadH的結構中，P295可能與DHU的D環形成疏水作用，可能涉及構象轉換，并且P295可能與附近的L294、A296、V352、P268以及P85形成一個疏水的區域，保證活性中心氧化反應的順利進行。當P282突變為Ser后可能會與T269形成氫鍵，而P295與底物DHU以及附近疏水性氨基酸之間的疏水作用被破壞，從而不利于反應的進行，所以造成了P295S活性的劇烈下降。

目前只有少數幾種 FAD依賴型單加氧酶的催化機理研究得比較深入。例如，PHBH、PgaE和CabE已經得到晶體結構，并且分析了PHBH和PgaE活性中心的關鍵殘基，推測了可能的反應機理[13,17,21]。通過異源表達和基因敲除等實驗對褐黃癌菌素[22]、竹桃霉素[23]、烏達霉素[24]合成基因簇中的JadH同源蛋白進行了功能研究，推測它們可能催化不同中間體的羥化反應。還有一些聚酮合成途徑中的黃素依賴型單加氧酶沒有得到詳細的功能研究，只是根據序列特征進行了功能推測，如 auricin合成基因簇中的 Aur1A和 Aur1I[25]，simocyclinone合成基因簇中的SimA7、SimA8和Sim7[26]，alpomycin合成基因簇中的 AlpG和 AlpF[27]等。除 PgaE的突變株H83A和P282S活性提高150%、K92Q活性與野生型相當，N289D和△377-491活性顯著降低外(≤1%)[17]，對這些芳香聚酮后修飾氧化酶結合或催化底物的可能關鍵氨基酸的功能分析鮮有報道。本研究首次構建了JadH的三維結構模型，除與PgaE中P282同源的P295外，第一次對JadH中的R50、G51、L52、G53、F100、R221、I223和G298進行了定點突變和體外酶學分析。實驗結果表明這9個氨基酸殘基是JadH底物結合或催化的關鍵氨基酸，推測：R50、L52、I223、P295、F100參與與底物 DHU之間的疏水相互作用；G298的主鏈氨基及 R221的側鏈胍基與底物DHU形成氫鍵，參與底物的識別；G53和 L52影響FAD的質子傳遞；G51影響酶的構象轉化。這為進一步研究JadH的催化機理及JadH近緣酶的功能提供了重要依據。

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