肌肉增強子因子2對豬肌肉生長抑制素啟動子活性的調節

李佳，鄧捷，張軍林，成德，王華巖

西北農林科技大學動物醫學院 動物生物技術系，陜西 楊陵 712100

肌肉生長抑制素 (Myostatin，Mstn) 又稱生長分化因子8 (Growth differentiation factor 8，GDF8)，屬于轉化生長因子 ? (Transforming growth factor beta，TGF-?) 超家族，是在骨骼肌中廣泛表達并且功能專一的一種糖蛋白。Mstn基因在發育早期及成熟期的骨骼肌及乳腺中高表達[1]，在心肌、脂肪組織和肝臟中低表達[2-3]。高表達 Mstn的轉基因動物會出現肌肉萎縮的現象[4-5]；在小鼠、牛、人等動物上，抑制Mstn的表達，則會出現骨骼肌明顯增生、肌肉尺寸顯著增加等現象[6-8]。因此，該基因是骨骼肌生長的抑制因子。研究該基因的轉錄調控機制，對提高動物產肉率方面具有重要意義。

相比于 Mstn的基因與蛋白結構和生物學功能，對 Mstn基因轉錄和表達的調控機制研究較少。在小鼠、人類、牛和羊等動物上，只完成對Mstn基因啟動子一些初步的功能預測，發現啟動子序列上存在糖皮質激素受體結合元件 (GRE)、肌肉調控因子結合元件 (E-box)、叉頭蛋白結合元件 (FOXO-box) 和肌肉增強子因子2 (MEF2)等因子的結合位點，它們對 Mstn基因的轉錄和表達起到一定的調控作用[7,9-11]。但是，由于Mstn基因的轉錄調控模式在不同動物間存在差異，這些調控元件在不同物種間，對 Mstn啟動子的調控作用和具體機制還需要繼續深入研究[10,12]。早期研究表明，MEF2可能通過結合Mstn啟動子的相關位點調節肌纖維類型相互轉換[13]；在心肌細胞內，MEF2與 Mstn啟動子的結合可以抑制心肌細胞增殖[14]。但在骨骼肌中，MEF2怎樣調控豬 Mstn啟動子活性尚不清楚；如果調控機制確實存在，還需要進一步確定激活Mstn啟動子的MEF2亞型和具體的結合位點。

本研究首先通過PCR方法擴增出1 969 kb豬Mstn的啟動子序列，利用生物信息學方法分析出啟動子全序列中所有的MEF2的結合位點；其次，比較了5個長度不等的啟動子在C2C12細胞中的活性。本實驗還選取含有 MEF2位點的啟動子片段，與MEF2C或MEF2A的表達載體共同轉入C2C12細胞，檢測啟動子活性的變化，確定 MEF2的主要結合位點。最后探討 2個MEF2亞型對Mstn mRNA水平和蛋白水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

C2C12細胞系為西北農林科技大學動物醫學院干細胞中心保存；pGEM-T Easy、pGL3-Basic、pCMV-Renilla、Dual Luciferase Reporter Assay、System kit、KpnⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、質粒提取試劑盒購自 Promega公司；T4 DNA連接酶購自 TaKaRa公司；LipofectamineTM2000脂質體購自 Invitrogen公司；RevertAidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit和Taq DNA聚合酶購自MBI公司；兔抗鼠Mstn抗體購自Abcam公司；兔抗鼠 b-actin抗體購自Sigma公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體購自SantaCruz公司；BCA Protein Assay Kit、ECL Western Blotting Substrate購自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 Mstn基因啟動子片段的克隆

按照Promega基因組提取試劑盒說明書，常規提取八眉豬肌肉組織基因組 DNA，檢測核酸濃度及純度。根據Mstn啟動子5′端序列 (GenBank Accession No. AY208121)，設計帶有酶切位點KpnⅠ和 XhoⅠ的啟動子上下游引物并擴增啟動子片段為1 969 bp。PCR采用25 μL體系，反應條件: 95 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃45 s，72 ℃ 90 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物連接在pGEM-T Easy克隆載體上，經測序驗證后克隆到pEGFP-1和pGL3-Basic表達載體中，分別命名為 pE2.0和 pL2.0。以 PCR產物為模板，分別設計帶有酶切位點 KpnⅠ和XhoⅠ的上下游引物，擴增852 bp、466 bp、218 bp和 137 bp的啟動子片段，測序后克隆到pGL3-Basic表達載體中，分別命名為 pL0.8、pL0.4、pL0.2和pL0.1。引物序列見表1。

1.2.2 MEF2A和MEF2C真核表達載體的構建

PCR引物根據GenBank中豬MEF2A的序列設計，帶有XhoⅠ和EcoRⅠ或SalⅠ的酶切位點，上下游引物序列見表1。按照常規RT-PCR方法從C2C12細胞中獲取cDNA。按上述PCR條件擴增MEF2A及MEF2C片段。經測序驗證后，將兩個片段克隆到pEGFP-C1表達載體中，分別命名為pE-MEF2A和pE-MEF2C。

1.2.3 細胞培養及瞬時轉染

C2C12成肌細胞 (Myoblast)，NIH3T3細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液，在37 ℃、含有5% CO2的細胞培養箱內培養，實驗時取對數生長期細胞。C2C12肌管細胞 (Myotube) 是將C2C12細胞培養在含2%馬血清的DMEM培養液中24 h后獲得。按照Lipofectine 2000使用說明，首先將pE2.0啟動子分別轉入C2C12成肌細胞和3T3細胞，轉染后30 h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。其次，將 C2C12成肌細胞或肌管細胞按2.4×104/孔接種于48孔培養板中，待細胞完全貼壁覆蓋率至 50%~60%時，將 pL2.0、pL0.8、pL0.4、pL0.2或pL0.1啟動子熒光報告載體 500 ng和 pCMV-Renilla表達載體 (內參) 50 ng共同轉入細胞，30 h后收集細胞并進行熒光素酶活性檢測。最后，將上述熒光報告載體分別同MEF2A或MEF2C表達載體 (4 μg) 共同轉入成肌細胞或肌管細胞，48 h后檢測熒光素酶活性。每種質粒做3次獨立實驗，每次3個復孔。

1.2.4 實時熒光定量PCR

轉染MEF2A或MEF2C表達載體60 h后，Trizol提取細胞總RNA，按照RevertAidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit相關說明進行反轉錄獲得cDNA，并設計qMstn和qGAPDH (內參) 引物。熒光定量PCR反應體系如下：2×SYBR Green Mix 10 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各 0.5 μL (10 pmol/L)，模板cDNA 1 μL，去離子水7 μL，共20 μL。每個樣本設3個重復，另設不加模板對照組 (以等體積的去離子水替代)。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，共40個循環；95 ℃ 10 s，56 ℃退火階段收集熒光信號。實時熒光定量PCR引物序列見表1。

1.2.5 Western blotting檢測

轉染后 72 h收集細胞，采用細胞裂解液(Promega公司) 提取總蛋白。將蛋白樣品與等量的2×上樣緩沖液混合，100 ℃變性5 min，冰上完全冷卻后上樣，進行 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。恒壓80 V轉PVDF膜4 h，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h后，1:500稀釋的Mstn抗體作用于4 ℃搖床過夜，或以1:2 000稀釋的β-actin抗體室溫作用1 h，PBST洗膜3次后，將膜與1:5 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后，加入ECL化學發光試劑，室溫孵育5 min，暗室曝光，顯影定影。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 統計學分析

所有數據均用平均值±標準偏差表示，并經雙尾t-test檢驗差異是否具有統計學意義。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 豬Mstn啟動子的構建及相關轉錄因子位點分析

從豬的基因組DNA克隆了1 969 bp的Mstn基因啟動子片段，并通過生物信息學分析豬Mstn啟動子上潛在的轉錄因子結合位點 (圖 1A)。在Mstn的5'端側翼50 bp以內存在2個獨立的TATA框；在-71 bp到-66 bp存在1個CAAT框；整個啟動子包括 16個 E-box，它的識別位點為CANNTG 序列，可以結合成肌分化抗原(MyoD)，生肌調節因子5 (MYF5)和生肌調節因子 6 (MYF6)等參與肌肉生長發育調節的轉錄因子。該啟動子上還包括3個潛在的MEF2結合位點 (TA(A/T)4TA)，一個近端的位點位于-189 bp到-206 bp (MEF2-1)；兩個遠端的位點分別位于-441 bp到-449 bp (MEF2-2)，-620 bp到-628 bp (MEF2-3)。

2.2 豬Mstn啟動子在C2C12及NIH 3T3細胞中的活性

首先，將pE2.0啟動子缺失報告載體分別轉入C2C12細胞和3T3細胞，30 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞。結果顯示，部分C2C12細胞表達綠色熒光而 3T3細胞沒有熒光蛋白的表達(圖1B)。這一結果證實了Mstn啟動子在肌細胞中表達的特異性。然后，將5個不同長度的啟動子片段分別轉入C2C12成肌細胞和肌管細胞中，觀察這些啟動子的活性。在成肌細胞中，轉入不同的 Mstn啟動子后，熒光素酶水平是轉入pGL3-Basic對照載體細胞的20~60倍，進一步證實該啟動子在肌細胞中充分激活 (圖2)。研究檢測的5個啟動子，它們的活性在成肌細胞中比在肌管細胞中要高2~3倍 (圖2)，這可能是因為成肌細胞中高表達一系列限制肌肉分化發育的轉錄因子，對Mstn啟動子發揮了一定的協同激活作用。

圖1 豬Mstn啟動子的序列分析及啟動子缺失載體pE2.0在C2C12細胞和NIH 3T3細胞中的激活Fig. 1 Sequence analysis of porcine Mstn promoter and the activation of promoter-less vector pE2.0 in C2C12 cells and NIH 3T3 cells. (A) The 1 969 bp porcine Mstn promoter was analyzed by MatInspector software. 16 E-Boxes were indicated by black box. (B) C2C12 (a and b) and NIH 3T3 cells (c and d) were transfected with pE2.0 constructs. a and c are fluorescent images; b and d are phase-contrast images. Scale bars=10 mm.

圖2 不同片段豬Mstn啟動子在成肌細胞及肌管細胞的活性檢測Fig. 2 Luciferase activity of five constructs with different sized Mstn promoter in myoblasts and myotubes.

基于熒光素酶檢測的結果，研究發現在1 969 bp Mstn基因啟動子片段中，包含了5個活性調控區域，包括 3個活性上調區 (1 bp至-137 bp、-137 bp至-218 bp、-218 bp至-466 bp和-466 bp到-852 bp) 和 1個活性下調區域(-852 bp至-1 969 bp)。其中，在第一個區域，結果顯示僅 137 bp的啟動子片段 (pL0.1) 足以激活啟動子活性 (該片段活性是對照載體的 15倍)。在-137 bp至-218 bp區域和-466 bp至-852 bp區域，熒光素酶活性顯著增加。在成肌細胞和肌管細胞中，報告載體pL0.2的活性分別是pL0.1的2倍和4倍，表明在-137 bp到-218 bp這一區域有重要的正調控轉錄因子參與 Mstn啟動子活性調節。從-218 bp至-466 bp，啟動子活性沒有明顯改變，提示這一區域可能不是 Mstn啟動子的關鍵調控區。

2.3 MEF2對豬Mstn啟動子活性的影響

在 C2C12細胞上，進一步探討了轉錄因子MEF2對豬 Mstn啟動子活性的調控。分別將MEF2A和 MEF2C兩個亞型的表達載體與不同的啟動子片段共同轉染成肌細胞或肌管細胞，60 h后檢測熒光素酶活性。分析發現，在高表達MEF2C基因后，含有MEF2結合位點的啟動子片段 (pL2.0、pL0.8、pL0.4和pL0.2) 活性明顯增強，不含有 MEF2結合位點的啟動子片段(pL0.1) 活性沒有顯著變化 (圖3A、B)。其中，含有MEF2-1位點的pL0.2活性變化最為明顯：在成肌細胞和肌管細胞，啟動子活性分別升高了6倍和5倍。含有全部3個MEF2位點的pL2.0和pL0.8，在加入MEF2C表達載體后，活性也顯著上升了2~3倍；含有MEF2-1和MEF2-2位點的pL0.4片段，其活性的增加只有pL0.2片段的50%。該結果表明，不同的MEF2結合位點對MEF2C的易感性不同，以近端的MEF2-1位點最為敏感，是MEF2C調節Mstn啟動子活性的重要位點。而高表達MEF2A基因后，各啟動子活性沒有明顯變化，說明MEF2A亞型可能在調控豬Mstn啟動子活性方面作用較為薄弱。

圖3 MEF2A和MEF2C對不同片段的豬Mstn啟動子活性的影響Fig. 3 Luciferase activity of different porcine Mstn promoter fragment response to MEF2A or MEF2C overepression in myoblasts and myotubes.

2.4 MEF2對豬Mstn轉錄水平及蛋白水平的調控

將MEF2A和MEF2C的表達載體分別轉染C2C12成肌細胞和肌管細胞，檢測Mstn的mRNA水平和蛋白水平的變化。結果顯示，在成肌細胞中，轉入MEF2C后，Mstn的mRNA水平只升高了約0.5倍，蛋白水平也變化不明顯 (圖4A)；在肌管細胞中，mRNA水平升高了4~5倍，而且蛋白水平也有顯著上調 (圖 4B)。與前面的結果相似，轉入MEF2A表達載體后，在兩種細胞中，Mstn的轉錄水平及蛋白水平都沒有明顯改變(圖 4A、4B)。以上結果提示，在肌肉發育過程中，特別是在分化為肌管細胞的過程中，MEF2C可能通過調節 Mstn啟動子活性從而增加其mRNA轉錄和蛋白翻譯。

圖4 轉染pC-MEF2A或pC-MEF2C后Mstn的mRNA水平和蛋白水平Fig. 4 Mstn mRNA and protein level after transfection of pC-MEF2A or pC-MEF2C in myoblasts and myotubes.

3 討論

在本研究中，我們首先構建了豬 Mstn啟動子，并把它克隆到啟動子缺失載體pEGFP-1中。pE2.0啟動子導入非肌肉細胞后，豬Mstn啟動子不表達。該結果證實 Mstn啟動子的在肌肉細胞內特異性表達。這與以前在人和羊上Mstn啟動子的報道一致[15]。

然后，我們發現 MEF2C的表達對豬 Mstn啟動子活性有顯著上調的作用。MEF2 (MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D) 是成肌細胞分化為肌肉特異性基因的轉錄因子[16]。在成年小鼠，MEF2C的表達僅限于骨骼肌、腦和脾；而MEF2A、MEF2B和MEF2D則廣泛表達于身體各個組織[17-18]。已有的報道發現，MEF2廣泛存在于肌肉細胞中，是最早被稱為具有肌肉特性的DNA結合活性因子，可與大多數肌肉特定基因，特別是堿性螺旋-環-螺旋蛋白家族成員 (Basic helix-loop-helix protein，BHLH protein) 的啟動子或增強子直接結合，激活骨骼肌相關基因的活性[19]。近期的研究發現，MEF2可以與一些負調控肌肉生長發育基因的啟動子相結合并增強該啟動子的活性，例如 Mstn[13]和 TRIM72[20]。在豬Mstn基因啟動子上，MEF2C結合位點的發現以及MEF2C增強Mstn轉錄活性的證據表明，該因子可以通過影響Mstn的表達來參與骨骼肌生長和分化的調節。此前，有報道證實，MEF2可以通過調節Mstn基因的表達改變小鼠骨骼肌肌纖維類型的組成[13]。而在心肌細胞的研究證實，MEF2通過與Mstn的啟動子DNA結合抑制心肌細胞增殖，并降低心臟重量[14]。在本實驗中，我們發現MEF2C是骨骼肌中發揮該調控機制的亞型。在成肌細胞中和肌管細胞中，高表達MEF2C后，豬Mstn啟動子活性增加了3~4倍。與此相對應的 mRNA轉錄水平和蛋白水平在成肌細胞中只升高了0.5倍左右，實際上不具有真正的生理學意義。該結果提示，在成肌細胞中，MEF2C還可能激活了其他信號通路，調控Mstn表達；而在肌管細胞中，mRNA轉錄水平和蛋白水平升幅程度與啟動子活性的激活程度相似，提示MEF2C可能在肌管發育期對Mstn的影響更為重要。由于Mstn的作用是限制骨骼肌生長發育，在肌管細胞內，MEF2C激活Mstn啟動子的現象可能是該因子負反饋調節抑制肌細胞增生的機制之一[20]。

總之，本研究克隆和分析了豬 Mstn基因啟動子序列，首次發現了并確定了該序列有 3個MEF2結合位點。其中，近端的MEF2-1位點最為重要，它是MEF2C在C2C12細胞中上調Mstn啟動子活性的重要結合位點。而且，在肌細胞中，MEF2C還可以通過上調Mstn啟動子活性增強該基因的轉錄和蛋白翻譯。本研究結果提示，MEF2C可以通過激活Mstn調節豬肌肉生長和發育，這將為以后通過調控 Mstn基因控制動物肌肉產量等方面提供新的理論依據。

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