小白菊內酯誘導耐藥白血病細胞K562/ADR凋亡的研究

石倩倩，丁亞輝，祁瑞哲，高瀛岱，楊 銘，紀 慶，羅 成

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457;2.南開大學藥學院，天津 300071; 3.實驗血液學國家重點實驗室，中國醫學科學院血液病醫院(血液學研究所)，天津 300020)

白血病是嚴重威脅人類生命和健康的惡性疾病，據統計，白血病在我國的發病率為3－4/10萬人。目前治療白血病的主要手段有化療、放療、骨髓移植等。在白血病的治療方法中，化療是常用和重要的治療手段，但常規化療藥易出現耐藥又有毒副作用，新設計開發的靶向藥物伊馬替尼(格列衛)也沒有明顯提高白血病的治愈率，耐藥性的發生依然是困擾臨床治療的一大難題。多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)是指腫瘤細胞對某一化療藥物產生耐藥性，對其他化學結構及機制不同的化療藥物也產生交叉耐藥性。MDR是導致化療失敗最重要的原因之一，也是腫瘤治療中亟待解決的問題。小白菊內酯(PTL)是來源于菊科植物的倍半萜內酯，一直用于治療偏頭疼和風濕性關節炎。近來學者研究發現，小白菊內酯具有較強的抑制腫瘤細胞增殖的活性，可誘導結腸癌、肝癌、多發性骨髓瘤、白血病、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤細胞凋亡，并對其他抗癌藥物具有增敏效應［1－3］。

白血病細胞K562/ADR是一種對一線化療藥多柔比星、長春新堿、伊馬替尼等耐藥的細胞系，本研究擬利用此細胞系研究小白菊內酯對耐藥白血病細胞是否能有較強的殺傷作用，以及是否能誘導耐藥細胞的凋亡。為解決白血病耐藥問題尋找可能的解決辦法，為小白菊內酯應用于耐藥白血病的治療提供一定的理論基礎。

1 材料

RPMI 1640培養基購自Gibco公司;K562和阿霉素長期誘導的耐藥細胞株K562/ADR由中國醫學科學院血液學研究所實驗室提供;MTT購自Sigma公司;RIPA細胞裂解液、Beyo ECL Plus顯色試劑、ROS檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術公司;細胞凋亡試劑盒購自BD公司;LDH釋放試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司;小白菊內酯化合物由南開大學陳悅教授實驗室提供，純度為99.9%，溶于DMSO。

2 方法

2.1 MTT檢測藥物的抑制活性 取對數生長期的K562和K562/ADR細胞，用含有10%血清的RPMI 1640培養基調整細胞濃度為1×109·L－1，接種于96孔板中，每孔180 μl。在37℃，5%CO2條件下培養1 h后，加入配制好的相應濃度的藥20 μl，每個濃度設6個復孔，處理組加入不同濃度的藥，對照組加入相應體積的生理鹽水。培養72 h后加入5 g· L－1的MTT 20 μl。37℃繼續培養4 h后棄上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩混勻后在酶標儀上檢測570 nm處光密度(OD)值。用軟件GraphPad Prism 5.01計算IC50值。

2.2 LDH釋放實驗檢測藥物的細胞毒作用 取處于對數生長期的K562和K562/ADR細胞，以不同濃度PTL處理24 h后加入96孔細胞培養板，5× 104細胞/孔，同時按步驟要求設置空對照孔(無細胞的培養液)、樣品對照孔(未處理的對照細胞)、樣品最大酶活性對照孔(未處理的后續裂解的細胞)，加入裂解液和補充液后，在5%CO2條件下繼續孵育培養1 h，離心后吸取上清，按照操作步驟先后加入反應底物和終止液。酶標儀測定D492值后，按下式計算殺傷百分率:處理樣品實際吸光讀數÷樣品細胞最大酶活性的實際吸光讀數×100%

2.3 細胞凋亡分析檢測藥物對細胞凋亡的作用取處于對數生長期的K562和K562/ADR細胞，以每孔1×108·L－1細胞懸液鋪入6孔板中，每孔2 ml。1 h后用不同濃度的藥物處理細胞。24 h后將6孔板中的細胞吸入流式管中。1 500 r·min－1離心7 min，棄上清，用1×Binding buffer將沉淀重懸，分別加入5 μl的Annexin-ⅤFITC和PI，室溫避光孵育15 min，加入300 μl的1×Binding buffer。FITC和PI的激發波長分別為488 nm、488 nm，1 h內進行流式檢測(流式細胞儀為BD LSRII數字化分析型流式細胞儀)。凋亡率包括早期和晚期凋亡率。

2.4 ROS水平檢測 取對數生長期的細胞，加入10 μmol·L－1PTL作用1 h，取5×105個細胞，加入流式管中，離心后棄上清。預冷的PBS洗1遍，用稀釋的10 μmol·L－1DCF-DA探針37℃孵育30 min。離心棄上清，用300 μl PBS重懸，激發波長為488 nm，上機檢測。為了檢測ROS在細胞凋亡中的作用。用5 mmol·L－1NAC預處理細胞1 h，與10 μmol·L－1PTL共同處理1 h后，步驟同上，檢測ROS的變化;與10 μmol·L－1PTL共同處理24 h后，同“2.3”中的步驟，檢測凋亡率的變化。

2.5 Western blot法檢測蛋白表達的變化 藥物處理后收集細胞，PBS洗1遍，用RIPA裂解液置冰上裂解30 min，超聲波裂解提取蛋白。4℃，12 000 r ·min－1離心10 min。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。12%的SDS-PAGE電泳分離上樣蛋白，濕轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶4℃封閉非特異性抗原過夜，孵育一抗、二抗。ECL化學發光法與暗室顯影。

3 結果

3.1 PTL對K562/ADR的增殖抑制作用 不同濃度(1.25、2.5、5、10、15、20、50 μmol·L－1)的PTL處理細胞72 h后，PTL對K562/ADR有明顯的抑制細胞增殖的作用，并呈劑量依賴性。PTL對K562/ ADR細胞的IC50值為:(4.36±0.37)μmol·L－1。PTL對K562細胞的IC50值為:(3.62±0.79)μmol ·L－1，經t檢驗，P＞0.05，兩者差異無顯著性。如Fig 1所示。

Fig 1 MTT assay of PTL cytotoxicity to K562，K562/ADR(±s，n=6)

3.2 PTL對K562/ADR的細胞毒作用 PTL對K562/ADR有明顯的細胞毒作用，并呈劑量依賴性。PTL對K562/ADR細胞的LC50值為:(10.6±2.81) μmol·L－1。PTL對K562細胞的LC50值為:(9.04 ±2.63)μmol·L－1，經t檢驗，P＞0.05，兩者差異無顯著性。如Fig 2所示。

Fig 2 LDH assay of PTL cytotoxicity to K562，K562/ADR(±s，n=6)

3.3 PTL誘導細胞凋亡率的測定 利用Annexin V-PI雙染法測定經10 μmol·L－1PTL處理細胞24 h后的細胞凋亡率。如Fig 2所示，10 μmol·L－1PTL能誘導K562/ADR細胞凋亡，凋亡率為(31.21 ±0.40)%，K562細胞的凋亡率為(29.15± 3.45)%，兩者的凋亡率差異無顯著性(P＞0.05)。結果說明，PTL能夠誘導耐藥細胞的凋亡，從而發揮抗腫瘤活性。

Fig 3 10 μmol·L－1PTL induced apoptosis of K562，K562/ADR for 24 h

3.4 PTL對K562/ADR細胞內ROS的影響 為了探討PTL誘導細胞凋亡是否與升高細胞內的ROS相關，并激活下游的凋亡通路。用10 μmol· L－1PTL處理細胞1 h，測定細胞內ROS的水平。結果顯示，10 μmol·L－1PTL處理細胞1 h，與對照相比，吸收峰明顯右移，如Fig 4所示。說明K562/ ADR細胞內ROS水平升高，與K562細胞相比差異無顯著性。為了驗證ROS在PTL誘導細胞凋亡過程的作用，以N-乙酰半胱氨酸(NAC)為ROS的清除劑。NAC預處理1 h，PTL與NAC共同處理細胞1 h后，細胞內ROS被抑制;PTL與NAC共同處理細胞24 h后，細胞 K562/ADR的凋亡率下降為(9.16±0.98)%，K562細胞的凋亡率為(5.24± 0.64)%。PTL單獨處理與PTL與NAC共同處理細胞凋亡率差異有顯著性(P＜0.05)。如Fig 5所示。

Fig 4 Increase of ROS in cells induced by PTL

Fig 5 Change of ROS level and apoptosis rate in K562，K562/ADR induced by PTL with NAC pretreatment

3.5 PTL誘導K562/ADR細胞內caspase-3、9蛋白的活化以及下調Bcl-2蛋白的表達 為了研究細胞凋亡的機制，我們檢測了 caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax幾種關鍵的凋亡相關蛋白。結果顯示，10 μmol·L－1PTL處理細胞24 h，K562/ADR、K562細胞內蛋白Bcl-2表達下調，Bcl-2和Bax比值降低，caspase-3、caspase-9酶源被激活，caspase-3出現降解片段。NAC預處理后，其蛋白表達恢復。如Fig 6所示。結果說明，PTL誘導的細胞凋亡在Bcl-2家族蛋白的參與下，由線粒體途徑介導信號傳導。

Fig 6 Expression of proteins Bcl-2，caspase-3，caspase-9 induced by PTL and PTL+NAC

4 討論

目前認為造成白血病發生、治療中耐藥和復發的根本原因是患者體內存在著一群白血病干細胞(leukemia stem cell，LSC)。2005年，Jordan等發現PTL能特異性靶向作用于白血病干細胞，而且對正常造血干細胞影響較小［4］。目前推測PTL特異性靶向LSC的機制是:核轉錄因子NF-κB在LSC中處于活化而在正常干細胞(HSC)中是非活化的，而PTL可以抑制 NF-κB的激活這一細胞生存途徑［5，13］。

我們的結果顯示，PTL能抑制耐藥白血病細胞K562/ADR的細胞增殖。10 μmol·L－1PTL處理細胞24 h能明顯誘導耐藥細胞的凋亡，而且與K562細胞相比差異無顯著性。K562/ADR、K562對常用一線化療藥多柔比星、長春新堿、格列衛的耐藥倍數分別為約100倍、約100倍 、約10倍，而PTL對K562/ADR、K562兩種細胞的殺傷、凋亡差異無顯著性。這說明PTL對耐藥白血病細胞的殺傷作用機制與其不同。

在通常情況下，急性、高濃度的ROS損傷DNA、蛋白質及脂質，引起細胞凋亡、壞死［6－9］。當胞內的ROS水平較高時，細胞色素C(CytC)從線粒體被釋放到胞質中，下調Bcl-2有助于CytC的釋放。胞質中的CytC與凋亡激活因子(apoptosis activating factor-1，Apaf-1)及pro-caspase-9形成凋亡小體，pro-caspase-9自身激活，形成有活性的caspase-9，后者進一步激活caspase-3、6、7等，進而導致細胞凋亡［10－12］。Western blot結果顯示，PTL均能夠下調Bcl-2，pro-caspase-9、pro-caspase-3蛋白的表達進而誘導細胞凋亡。用NAC預處理后，能恢復它們的表達。這說明PTL對凋亡的誘導作用與ROS的參與相關。

綜上，PTL對耐藥白血病細胞具有較好的抑制活性，并誘導其凋亡，可能的機制是其刺激細胞內的ROS升高，下調Bcl-2蛋白表達，進而激活線粒體凋亡通路誘導細胞凋亡。PTL有可能成為治療臨床耐藥白血病的潛在藥物。

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