雌孕激素序貫性干預治療對雷公藤多苷卵巢功能損害的保護作用

張丹鳳，郝 麗，徐星銘，閆軍放，丁 楠

(1.安徽醫科大學第二附屬醫院腎臟內科，安徽合肥 230601;2.安徽醫科大學第一附屬醫院腎臟內科，安徽合肥 230022)

雷公藤多苷(tripteryium wilfordii polyglycosidium，TWP)是植物雷公藤的根提取物，廣泛應用于腎小球疾病、風濕性疾病、腫瘤及移植等［1］。長期應用會產生肝功能受損和白細胞減少等不良反應，對性腺的損傷尤為突出，可引起月經紊亂，甚至卵巢早衰［1］。如何在充分發揮TWP療效的同時，最大限度地降低其副作用是臨床亟待解決的問題。研究發現HPT能夠改善TWP所致育齡期女性卵巢功能減退或衰竭引起的圍絕經期癥候群，維持血清中雌激素(E2)、卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的正常水平，減少TWP對女性生殖系統的毒副作用［4］。

FOXL2基因是目前發現的決定卵巢分化最早的標志性啟動基因，其通過轉錄調控作用調節靶基因轉錄、蛋白表達，參與顆粒細胞增殖分化。本文通過動物實驗，從基因轉錄水平探討HPT對TWP所致卵巢早衰的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 昆明♀小鼠30只，8周齡，體質量25～28 g，清潔級，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要材料與儀器 TWP為上海復旦復華藥業有限公司產品，批號110201;戊酸雌二醇(補佳樂)為法國先靈公司生產，廣州先靈藥業有限公司分裝，批號20110501;醋酸甲羥孕酮片為上海華聯制藥有限公司產品，批號:20110701;孕馬血清促性腺激素(PMSG)購自內蒙古赤峰博恩藥業有限公司;人絨毛膜促性腺激素(HCG)購于寧波激素二廠(每支1000IU);性激素測定藥盒由天津九鼎生物工程公司提供;逆轉錄試劑盒、PCR試劑和Taq DNA聚合酶均產自美國Fermentas公司。ABI7500型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品;GSM凝膠圖像分析管理系統為美國Sim公司Bio-pro CN-UV型產品。

1.3 方法

1.3.1 分組 選取30只♀昆明系小鼠適應性飼養1周后，按體重隨機分3組(每組10只)，灌胃給藥。

1.3.2 給藥 Control組:每天給予等量生理鹽水;TWP組: TWP 20mg·kg－1·d－1;TWP+HPT組:TWP 20 mg·kg－1· d－1+HPT(給予戊酸雌二醇0.2 mg·kg－1·d－1，至d 4，再加用醋酸甲羥孕酮片1.5 mg·kg－11次，兩藥同時停用1 d后重復下一療程)，5 d/每療程，共17療程。每周按體重調整給藥量［3－4］。

1.3.3 促排卵處理 17個療程后，對3組小鼠均進行促排卵處理:腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)10 U，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10U，16～18 h后處死，取卵巢稱重及顆粒細胞的收集，采用眼球摘除取血法取血，靜置2 h后，2 500 r·min－1離心5 min，留取血清待檢。

1.3.4 血清性激素的測定 ELISA法測定血清中雌激素(E2)、黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的水平。

1.3.5 卵巢稱重及顆粒細胞的收集 將取出的卵巢剝離周圍脂肪和被膜后，用濾紙吸干，萬分之一天平稱濕重，按公式計算卵巢指數:卵巢指數/%=卵巢濕重(mg)/體重(g)× 100%;參照文獻進行顆粒細胞收集［5］。

1.3.6 實時熒光定量PCR法檢測卵巢顆粒細胞FOXL2 mRNA的表達 按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，紫外分光光度儀檢測其質量和濃度。按照逆轉錄試劑盒說明，冰上操作將不同時間點的RNA逆轉錄成cDNA。再以逆轉錄出的cDNA為模板建立反應體系(20 μl)。引物由TaKaRa公司合成，序列如下:FOXL2(擴增片段長度73 bp)Forward primer 5'-GCGGACGCGCAGTCAAAGAGG-3'，Reverse primer 5'-TTCT CCGGTGTTGTCCCGCCT-3'。GAPDH(擴增片段長度173 bp)Forward primer 5'-ACGGCACAGTCAAGGCCGAG-3'，Reverse primer 5'-ACCCTTCAAGTGGGC CCCGG-3'。反應體系如下:總體積20 μl:2×Goldstar Taqman mixture 10 μl，DEPC H2O 7.2 μl，probe 0.8 μl，cDNA 0.2 μl。反應條件: 95℃ 10 s，接以40個循環:95℃ 15 s，0℃ 1min。實驗采用3個復孔并同時擴增GAPDH作為內參照。反應結束后，用7500 Fast Real-time PCR System軟件分析，繪制PCR定量標準曲線，mRNA水平以相對定量(relative quantification，RQ)表示。

1.3.7 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件，實驗數據以±s表示。多組間比較用方差分析。

2 結果

2.1 TWP和HPT聯合用藥對小鼠血清性激素的影響 實驗結束時30只小鼠全部存活。與Control組相比，TWP組小鼠卵巢分泌的E2水平明顯下降，垂體分泌的FSH、LH水平明顯升高，性激素變化差異有統計學意義(P＜0.01)。HPT組小鼠血清性激素水平與Control組相比變化無差異，與TWP組相比，E2水平明顯升高，垂體分泌的FSH、LH水平明顯下降，具有統計學意義(P＜0.01，Tab 1)。

Tab 1 Changes of levels of serum gonadal hormone in each group(±s，n=30)

Tab 1 Changes of levels of serum gonadal hormone in each group(±s，n=30)

＊＊P＜0.01 TWP vs control，△△P＜0.01 TWP+HPT vs TWP

Group E2/ng·L－1 LH/IU·L－1 FSH/IU·L －1 Control 6.9940±0.4971 1.2130±0.1529 1.3750±0.1018 TWP 5.0600±0.5319＊＊1.8960±0.2051＊＊1.8690±0.1348＊＊TWP+HPT 6.6400±0.8721△△1.3480±0.1642△△1.4010±0.1663△△

2.2 TWP和HPT聯合用藥對小鼠卵巢指數的影響 與Control組相比，TWP組小鼠卵巢指數明顯下降(P＜0.01)，而TWP+HPT組小鼠卵巢指數則無明顯差異(P＞0.05)，結果見Tab 2。

Tab 2 Changes in humid index of ovaries(±s，n=10)

Tab 2 Changes in humid index of ovaries(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 TWP vs control;△△P＜0.01 TWP+HPT vs TWP

Group Humid of index ovaries/% Control 0.0434±0.0187 TWP 0.0367±0.0179* TWP+HPT 0.0448±0.0177△△

2.3 TWP和HPT聯合用藥對小鼠卵巢mRNA的影響 Fig 1顯示，與Control組相比，TWP組FOXL2 mRNA轉錄水平下降，其2－ΔΔCt值僅為0.473，差異具有統計學意義(P＜0.05);與TWP組相比，TWP+HPT組FOXL2 mRNA拷貝數增高，其2－ΔΔCt值為0.781，且差異具有統計學意義(P＜0.05)。

4 討論

TWP多環節的免疫抑制作用，使它在治療免疫性疾病中有著獨特的地位，并在臨床應用中已取得了良好的療效［6］。但TWP對卵巢細胞毒副作用，使其在育齡和育齡前患者的長期維持性治療中受到很大限制。本研究結果顯示，TWP組小鼠卵巢指數明顯下降，同課題組另一病理研究發現TWP組小鼠卵巢組織受損明顯，卵泡較小，各級卵泡均有明顯的減少，且閉鎖卵泡增多［7］。卵巢功能表現為高促性腺激素型受損，E2分泌明顯減少，血清FSH、LH水平明顯升高，提示雷公藤多苷對卵巢組織結構及下丘腦-垂體-性腺軸均有明顯損害。本實驗將從維持卵巢功能方面發揮重要作用的人類常染色體基因—FOXL2基因著手，探討其損傷機制。研究表明［8］，FOXL2基因位于3號染色體的3q23區域，在成年小鼠的卵泡細胞中高度表達，是卵泡的維持和顆粒細胞的分化必需基因，在FOXL2突變的小鼠，顆粒細胞不能完全轉換為立方形，從而導致次級卵泡的缺失及卵母細胞的閉鎖，進而影響卵巢功能［9］。另外，FOXL2的失活則會增加StAR、CYP19、CYP11A和CCND2基因在小卵泡和未成熟卵泡中的表達從而加速卵泡的發育，導致原始卵泡增多，出現卵巢早衰［10－11］。本實驗發現，TWP組小鼠FOXL2 mRNA轉錄下調，提示TWP可能通過干擾FOXL2 mRNA轉錄從而導致小鼠出現卵巢早衰表型。

Fig 1 FOXL2 mRNA expression levels from different groups(±s，n=10)

雌孕激素序貫性替代治療廣泛應用于防治卵巢早衰及絕經后相關癥狀［4］。對TWP致繼發性POF患者給予HPT，可以改善低性激素水平，維持月經及第二性征，有效率達90.47%［2］。本實驗根據正常小鼠周期及體內性激素水平的變化［12］，在應用TWP的同時伍用HPT，結果顯示，E2性激素水平和卵巢指數升高，LH和FSH水平降低，FOXL2 mRNA拷貝數增加，提示HPT對TWP所致雌性小鼠卵巢損傷有較好的保護作用，可以上調小鼠顆粒細胞FOXL2 mRNA轉錄，從而促進卵泡的生長發育。

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