海馬神經元α7型煙堿樣乙酰膽堿受體的失敏特征

沈 磊，崔文玉，陳汝筑，汪 海

(1.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，北京 100850;2.中山大學中山醫學院藥理學系，廣東廣州 510080)

失敏(desensitization)是指在反復或長時間激動劑刺激下，生物學反應降低或消失的一種可逆現象，被認為是一種暫時性失活［1］。作為第1個被發現具有失敏過程的受體，煙堿樣乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)是一類含半胱氨酸環的配體門控離子通道受體，由5個亞基構成［2］。在中樞神經系統廣泛分布的1個N受體亞型是α7型煙堿樣乙酰膽堿受體(α7-nAChR)，它由5個相同的α亞單位組成，以快失敏和對鈣離子的高通透性而有別于其他類型的N受體［3－4］?？焓暨@個特征具有很重要的作用，在生理狀態下參與了細胞保護，避免細胞受激動劑作用后的過度興奮，也參與了神經遞質釋放的調節，并參與了突觸可塑性對其他受體功能的調節。病理條件下參與了長期吸煙后的成癮癥狀和有機磷中毒癥狀［5－6］。所以研究 α7-nAChR的失敏特征有助于理解失敏態N受體的特殊功能。本文使用膜片鉗全細胞記錄方式來探討α7-nAChR的特異激動劑——膽堿對海馬神經元中含α7-nAChR失敏過程的影響。

1 材料與方法

1.1 新生大鼠海馬神經元培養 取12 h內出生的Sprague-Dawley大鼠，經75%乙醇浸泡消毒后，取全腦放入0℃的高糖DMEM培養液中沖洗，在解剖顯微鏡下分離出海馬組織，并仔細剝離附著血管膜和皮層組織，然后用小鑷子將海馬搗碎，放入含2 g· L－1木瓜蛋白酶的DMEM培養液中，于37℃、5%二氧化碳孵箱中消化20 min，用含血清的DMEM/F12培養液中止消化，然后以1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，重懸于DMEM/F12培養液，用不同口徑的滴管分批次輕輕吹打分散細胞，將分散好的細胞懸液加入預先涂了多聚賴氨酸的35 mm培養皿中(在4℃放置過夜后吸出備用)，于37℃、5%二氧化碳孵箱中培養1 d后將含血清培養液全部換為無血清并含2%B-27的Neurobasal-A培養液(該無血清培養液可以抑制膠質細胞的生長，而加入B-27可保證神經元的正常生長)，以后每3天用無血清培養液半量換液1次。膜片鉗實驗采用培養10～15 d，有明顯的胞體和神經突觸的神經元。

1.2 全細胞膜片鉗實驗 使用MultiClamp 700B放大器和pClamp9.2軟件采集和分析數據。記錄電極用硬質有芯玻璃經電極拉制儀拉制而成，電阻為2～4 MΩ。用細胞外液替換培養液，記錄電極與細胞表面形成高阻封接后電擊破膜形成全細胞記錄模式。補償膜電容和串聯電阻后將細胞膜電位鉗制于－80 mV，被動記錄受體介導電流。采樣頻率為5 kHz，低通濾波頻率為2 kHz。給藥方式有兩種，激動劑由微量注射儀(PicospritzerⅢ)向細胞表面噴射給予，給藥后立即移出培養皿，阻斷劑由蠕動泵灌流給予(2 ml·min－1)。細胞外液的組成為(mmol ·L－1):NaCl 140，KCl 5，MgCl21，CaCl22，D-glucose 10，HEPES 10，用NaOH調pH 7.4。加入0.5 μmol ·L－1TTX阻斷自發性動作電位產生。電極內液的組成為(mmol·L－1):CsCH3SO3130，CsCl 6，MgCl22，MgATP 4，EGTA 2，HEPES 10，用 CsOH調 pH 7.2。所有實驗在室溫(22℃ ～25℃)下進行。記錄全過程均用正常外液進行灌流。

1.3 試劑 Choline、Methyllycaconitine(MLA)、αbungarotoxin(α-BGT)、Tetrodotoxin(TTX)、Mg-ATP、HEPES、多聚賴氨酸均為Sigma公司產品。DMEM、DMEM/F12、B-27、胎牛血清為Gibco公司產品。

1.4 數據分析 誘發電流用pClamp9.2軟件測量分析，電流衰減部分用單指數方程擬合。數據用ˉx ±s表示，n表示細胞數，用SPSS軟件進行方差分析，組間比較采用LSD法。使用Origin 8.1軟件進行作圖，用Boltzmann擬合失敏恢復曲線。

2 結果

2.1 α7-nAChR介導電流的電生理學特征 將細胞膜電位鉗制在－80 mV，向形成全細胞模式的海馬神經元表面局部噴射10 mmol·L－1膽堿1s可誘發出一內向電流，該電流具有快激活和快失活的動力學過程。在所記錄的117個細胞中，有90個細胞對膽堿有反應，舍棄電流峰值＜100 pA的數值(8個)后，電流的峰值為(875±51)pA、10%～90%上升時間(反應激活過程)為(21±2)ms、對失活過程進行單指數擬合后得到失敏時間常數tau為(77± 5)ms(n=82)。膽堿誘發電流可以被MLA完全可逆阻斷，持續灌流含10 nmol·L－1MLA的外液5 min可以使電流峰值降為0，而換為正常外液洗脫20 min后，電流峰值恢復到正常水平的68.3% ± 3.4%(n=4);該電流也可以被α-BGT完全不可逆阻斷，持續灌流含100 nmol·L－1α-BGT的外液5 min使電流峰值降為正常水平的5.3% ±2.7%，而換為正常外液洗脫30 min后仍然無膽堿誘發電流出現(n=3)，兩種阻斷劑的特異性阻斷進一步證明膽堿誘發電流為α7-nAChR介導電流。有些膽堿誘發電流在結束給藥后會出現rebound電流(反跳電流)，這是因為在暴露于高濃度激動劑時，一部分開放的通道被激動劑所阻斷，而在移除激動劑后恢復開放的現象［7］。(Fig 1)

Fig 1 Characteristics of choline-evoked currents in cultured hippocampal neurons

2.2 高濃度膽堿誘導α7-nAChR的失敏特征

2.2.1 高濃度膽堿對受體激活和失敏的時-效關系影響 將細胞膜電位鉗制在－80 mV，向形成全細胞模式的海馬神經元表面局部噴射不同時間的10 mmol·L－1膽堿可以得到一系列膽堿誘發電流。10、20、50、100、200、500、1 000和10 000 ms的膽堿誘發電流的標準化電流幅度(以1 000 ms膽堿誘發電流幅度為100%)分別為:7.0%±3.5%、31.0% ±8.4%、93.9% ±6.4%、100.0% ±4.4%、100.5%±8.8%、93.7% ±3.9%、100.0% ±0.0 %和99.9%±4.0%(n=5);20、50、100、200、500、1 000和10 000 ms的膽堿誘發電流的10%～90%上升時間分別為:(38±8)、(23±4)、(15±3)、(16± 1)、(18±3)、(15±2)和(17±2)ms(n=5);20、50、100、200、500、1 000和10 000 ms的膽堿誘發電流的失敏時間常數(tau)分別為:(167±33)、(78± 25)、(59±13)、(57±14)、(42±11)、(49±13)和(72±22)ms(n=5)。這些數據說明當給膽堿的時間≥100 ms時，不同給藥時間對α7-nAChR的激活和失敏過程基本無影響(Fig 2)。

2.2.2 高濃度膽堿刺激時間對受體失敏恢復的影響 將細胞膜電位鉗制在－80 mV，采用配對刺激研究給膽堿不同時間對α7-nAChR失敏恢復的影響。配對刺激含有一個條件刺激(給予不同時間的膽堿)和間隔一定時間后的一個測試刺激(給100 ms的膽堿)，每對刺激間隔120 s以保證受體功能完全恢復。結果為:當給予100 ms的膽堿作為條件刺激時，受體完全失敏的時間≤5 s，受體從失敏態恢復一半所需時間為(28.6±5.7)s(n=4);當給予1 s的膽堿作為條件刺激時，受體完全失敏的時間≤10 s，受體從失敏態恢復一半所需時間為(32.4± 2.4)s(n=6);而當給予10 s的膽堿作為條件刺激時，受體完全失敏的時間≤20 s，受體從失敏態恢復一半所需時間為(31.1±1.1)s(n=4)，3種條件刺激下受體從失敏恢復的半數恢復時間兩兩比較差異無顯著性。這些數據說明延長高濃度膽堿的作用時間不影響α7-nAChR從失敏態的恢復，但可以延長α7-nAChR的完全失敏時間(Fig 3)。

Fig 2 Effects of choline at the concentration of 10 mmol·L－1on activation and desensitization of choline-evoked currents in cultured hippocampal neurons

2.3 低濃度膽堿誘導的α7-nAChR的失敏特征將細胞膜電位鉗制在－80 mV，加入100、50和10 μmol·L－1膽堿持續灌流海馬神經元誘導 α7-nAChR失敏，之后用正常外液洗脫觀察受體從失敏態的恢復。于正常期、失敏期和洗脫期用10 mmol ·L－1膽堿給100 ms測試受體功能。結果為:用含100 μmol·L－1膽堿的細胞外液作用神經元1、3、6和10 min后可使10 mmol·L－1膽堿誘發電流下降到正常對照電流水平的75.2%±12.1%、47.0%± 16.2%、15.7%±3.5%和8.1% ±0.6%，用正常外液洗脫后的1、3、6和10 min使電流恢復到正常對照電流水平的35.0% ±11.4%、61.0% ±8.2 %、68.8%±9.3%和80.3%±4.8%(n=5);用含50 μmol·L－1膽堿的細胞外液作用神經元1、3、6和10 min后使10 mmol·L－1膽堿誘發電流下降到正常對照電流水平的92.8% ±1.3%、70.8% ±4.3 %、46.4%±5.1%和41.6%±4.1%，用正常外液洗脫后的1、3、6和10 min使電流恢復到正常對照電流水平的 49.9% ±5.1%、68.0% ±1.8%、69.8%±1.8%和74.7% ±0.6%(n=4);而用含10 μmol·L－1膽堿的細胞外液作用神經元1、3、6和10 min后，10 mmol·L－1膽堿誘發電流水平為正常對照電流水平的97.4% ±2.6%、104.2% ±5.2 %、96.9%±5.9%和94.1%±8.4%，用正常外液洗脫后的1、3、6和10 min誘發電流為正常對照電流水平的94.5%±7.2%、92.8%±4.1%、96.4% ±3.2%和95.9%±2.2%(n=4)。這說明盡管低濃度膽堿激動α7-nAChR的能力不夠(100 μmol· L－1膽堿誘發電流幅度為 10 mmol·L－1膽堿的19%，數據未列出)，但足以使受體失敏，失敏程度隨激動劑濃度和作用時間的增加而加深(Fig 4)。

Fig 3 Effects of choline at the concentration of 10 mmol·L－1 on recovery from desensitization of choline-evoked currents in cultured hippocampal neurons

3 討論

作為記憶和認知功能形成的中樞，海馬含有豐富的神經元型nAChR，接受內源性神經遞質—ACh后調控其他神經遞質的釋放或者直接產生突觸后效應。海馬中的 N受體有多種亞型，如 α4β2、α4α5β2、α3β4、α7等，其中α7型受體介導的電流對MLA和α-BGT敏感［8］。膽堿是α7-nAChR的選擇性激動劑，本實驗中用10 mmol·L－1膽堿誘發電流為快激活和快失活電流，且能被10 nmol·L－1的MLA和100 nmol·L－1的α-BGT完全阻斷，說明該電流為膽堿激活α7-nAChR引起。

以膽堿為工具藥研究海馬神經元α7-nAChR的失敏特征，發現:(1)10 mmol·L－1膽堿(高濃度)誘導的α7-nAChR的失敏速度很快;(2)10 mmol·L－1膽堿誘導的α7-nAChR從失敏態恢復的速度也很快(3)當給藥時間≥100 ms時，延長高濃度膽堿的作用時間并不影響α7-nAChR的失敏速度;延長作用時間也不影響受體從失敏態的恢復;但是延長作用時間延長了受體處在完全失敏態的時間。這說明只要給藥時間足夠誘發完整電流，α7-nAChR的失敏及其恢復就與給藥時間無關，暴露于激動劑更長時間可能僅僅只是增加了受體對下一場刺激的絕對不應期;(4)低濃度膽堿(≤100 μmol·L－1)持續灌流也可以使受體緩慢失敏，失敏程度與膽堿的濃度有關;而失敏恢復的程度未觀察到與膽堿的濃度有關，這可能是由于洗脫時間不夠長(約10 min)，100和50 μmol·L－1膽堿誘發的受體失敏還未完全恢復。

Fig 4 Desensitization of choline-evoked currentsto choline at the concentration of 100，50 and 10 μmol·L－1in cultured hippocampal neurons

自從Katz和Thesleff從骨骼肌N受體發現受體失敏現象后［9］，經典的失敏就是繼發于受體的激活，即靜息態受體被激動劑誘發為激活態后馬上變構為失敏態。之后這種理論又補充了低濃度激動劑(無明顯誘發電流產生的濃度)慢性孵育也可以誘發受體失敏的內容，這是由于失敏態受體對于激動劑的親和力遠高于激活態受體，因此低濃度激動劑使受體越過激活態而直接進入失敏態，這種失敏也被稱為“高親和力失敏”(high-affinity desensitization，HAD)［10－11］。HAD對于膽堿的生理作用可能更為重要，因為相比較ACh在突觸間隙的瞬間高濃度激動受體的作用，作為ACh水解產物的膽堿在生理條件下的細胞外液濃度為4～10 μmol·L－1［12］，該濃度很難激活大量α7-nAChR，然而在反復的沖動傳遞過程中，膽堿濃度有可能累計，從而產生HAD來限制ACh對突觸后細胞的過度興奮來保護細胞。

總的來說，隨著失敏態α7-nAChR的功能越來越被重視，本實驗為應用膽堿來研究α7-nAChR的失敏功能提供了依據。

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