腫瘤干細胞耐藥機制研究進展

趙小琴，符立梧

(華南腫瘤學國家重點實驗室，中山大學腫瘤防治中心，廣東廣州 510060)

腫瘤是一種干細胞疾病，其發生、發展與腫瘤干細胞有十分密切的聯系。克服CSCs先天性和獲得性耐藥是目前臨床上治療大多數具有侵襲性和轉移性腫瘤的重大挑戰。

1 干細胞、側群細胞和腫瘤干細胞

干細胞(stem cells)是一類未分化的原始細胞，具有多向分化潛能及自我更新能力。特定條件下，可以分化成不同特定功能的細胞，形成多種組織和器官。

側群(side population，SP)細胞能將進入細胞的熒光染料Hoechst 33342排出胞外，并在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞檢測時表現為不著色或淺著色的細胞，該特性的形成與跨膜轉運蛋白ABCG2的表達有著密切關系［1］，并具備干細胞“永生”和處于靜止狀態的特性。

CSCs是存在于腫瘤中的一小部分具有干細胞特性的細胞群體，通過不對稱性分裂維持自我更新和多向分化潛能，導致腫瘤細胞不斷增殖，促進腫瘤異質性和多樣性的形成。CSCs具有很強的抗損傷與轉移能力，故可能為腫瘤耐藥、惡性腫瘤治療后復發及腫瘤轉移的根源。

2 CSCs的生物學特性

首先，CSCs具有干細胞的特性，CSCs具有強大的增殖分化潛能;此外具有SP細胞特性，即通過高表達ABCG2有效地將化療藥泵出細胞外，導致腫瘤的耐藥和復發;與腫瘤的轉移密切相關;促進腫瘤血管的生成。近年來，主要是基于特異的細胞表面標志、SP細胞特性、懸浮培養、BrdU法和異體移植實驗等方法來分離與鑒定不同腫瘤的CSCs，歸納總結如Tab 1所示。

Tab 1 Biomarker used for the identification CSCs

CD133+ALDH 2008尤文氏肉瘤［16］ CD133+ 2009骨肉瘤［17］ Oct-4+ 2009 CD133+ 2008 ALDH 2010黑色素瘤［18］ netin+CD133+CD166+ 2007 Bmi-1+ 2007神經膠質瘤［19］ A2B5+ 2008 CD133+nestin+ 2008 CD133+ 2006喉癌［20］ CD133+ 2007鼻咽癌［21］ cytokine 19+ 2007頭頸部鱗狀細胞癌［22］ CD44+ 2007 CD44+ALDH 2010膀胱癌［23］ Oct-4+ 2007子宮內膜癌［24］ Musashi-1+ 2008 CD133 2009卵巢癌［25］ CD133+ 2008 CD44+CD117+ 2008 CD44+MyD88 2009

其次，CSCs還具有腫瘤細胞的特性，這是區別CSCs和正常干細胞的根本所在。CSCs的染色體核型為多倍體，不同于正常干細胞的二倍體，并且CSCs在接種后具有高致瘤和高轉移的特性。

3 CSCs與耐藥

腫瘤多藥耐藥是導致化療失敗的重要原因。CSCs具有對各種化療藥物的耐受性，就其較為明確的主要耐藥機制可從niche微環境、ABC轉運蛋白、DNA損傷修復功能3個方面概括。

3.1 niche微環境的改變 干細胞niche是干細胞生存所必需的一個微環境，是一個分散的動態的功能性區域，是由細胞－細胞，細胞－細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，細胞－可溶性因子的相互作用，以及細胞的物理狀態和幾何約束力組成。niche能保持CSCs自我更新、分化和靜息的功能［26］。鑒于 niche能夠維持 CSCs的活性，破壞 CSCs與niche的相互作用也許能夠克服化療耐藥。

1978年，Schofield［27］首次提出起源于脾集落形成細胞(spleen colony-forming cells，CFU-S)的定向造血干細胞與骨髓造血干細胞相比增殖減慢，此現象歸因于失去了長期支持干細胞活動的“niche”。在線蟲和果蠅體內發現了體細胞支持細胞能夠產生維持種系干細胞(germline stem cell，GSCs)的必須因子，為“niche”的存在提供了證據。

Niche中研究比較多的是HH、Wnt、Notch和SCF/c-KIT。正常干細胞的生存有賴于以上信號途徑的調控，上述信號通路異常時可能會導致腫瘤細胞增殖。此外，干細胞niche能通過為干細胞提供一些可溶性因子，如:GM-CSF、GMSF、IL-6、VEGF和TGF-β，調節化療耐藥表型的表達。因為其中多種藥物能夠誘導IL-6抑制凋亡。所以以這些可溶性因子為靶點進行治療可能抑制CSCs的抗凋亡功能從而提高腫瘤的治療效果。

3.1.1 Wnt信號通路 Wnt信號能夠促進干細胞發育，調節干細胞成熟以及介導細胞增殖、分化、存活、凋亡及細胞運動，是目前研究最多的信號通路。Wnt/β-catenin信號通路在維持CSCs的數量和特性如耐藥性、克隆形成能力、體內成瘤性等方面起著重要作用，這種作用已在白血病、肝癌、大腸癌、皮膚癌等腫瘤中證實。慢性粒細胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)由慢性期轉變為急性期時，伊馬替尼耐藥與作為Wnt/β-catenin轉錄標志的核內β-catenin的升高相關［28］。Wnt/β-catenin信號可能在ABCB1/MDR-1轉錄過程起重要作用［29］。胚胎干細胞標記物Oct-4，最近被證實其在維持肺癌細胞的侵襲、克隆形成、耐藥方面有著重要作用，可能為肺癌CSCs的一個重要的分子標記。Teng等［30］發現用氯化鋰激活Wnt/β-catenin信號通路后，肺癌A549細胞系的增殖、克隆形成、轉移以及耐藥性等方面的功能明顯增強，表明Wnt信號可能通過Oct4對肺癌CSCs的特性(如耐藥性等方面)產生重要影響。

Fig 1 The basic concept of a stem cell niche

3.1.2 Hedgehog信號通路 Hedgehog簡稱為HH通路，有研究證明HH信號調節膠質母細胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、多發性骨髓瘤、慢性粒細胞性白血病中的CSCs。HH-Gli信號通路是維持成熟神經干細胞和CD133+神經膠質瘤干細胞樣細胞增殖和自我更新所必須［31－33］。用跨膜蛋白Smoothened (Smo)抑制劑環杷明(cyclopamine)或者siRNA阻斷HH-Gli通路，能夠明顯降低神經膠質瘤干細胞樣細胞自我更新的能力［33］。Liu等［34］發現在標記有CD44+/CD24－/low/Lin-的人乳腺癌干細胞中HH通路被激活，HH信號和Bmi-1基因共同調節人乳腺癌CSCs以及正常干細胞的自我更新。對伊馬替尼耐藥的 Bcr-Abl+的白血病干細胞(leukemic stem cells，LSCs)可能導致慢性髓細胞白血病病人復發和耐藥的產生。上調Smo表達能激活LSCs中的HH通路，促進LSCs增殖，而抑制HH通路后能誘導Bcr-Abl+細胞凋亡，減少LSCs，提示抑制Smo可能有效抑制對伊馬替尼耐藥的LSCs增殖［35］。HH通路的激活可促進多發性骨髓瘤干細胞生長，而不影響其分化;阻斷HH通路則顯著抑制多發性骨髓瘤干細胞克隆增殖。研究還發現［36］沉默p70S6K2可降低Gli基因的活性，引起HH通路活性降低，同時伴隨細胞活性的明顯下降。可以推斷，抑制p70S6K2可以下調HH/Gli通路，從而影響干細胞的擴增，成為非小細胞肺癌的治療靶點之一。

3.1.3 Notch信號通路 在乳腺癌中，ESA+/CD44+/ CD24low的或者抗凋亡的CSCs的活性受Notch-4受體信號通路的特定調控。p66Shc基因是通過在缺氧環境下誘導乳腺癌細胞所鑒定出來，能控制干細胞調節基因Notch-3的表達。p66Shc/Notch-3相互作用能調節乳腺干細胞或者祖細胞的自我更新和低氧環境下的生存率［37］。GSIs是一種Notch-4單克隆抗體，能夠明顯降低乳腺原位導管癌形成球囊(即微球體，是干細胞樣細胞的指標之一)的能力。在腦腫瘤中，阻斷Notch信號通路能明顯抑制CD133+細胞和SP細胞的生長。在干細胞樣細胞中Notch信號明顯高于普通細胞，推斷這些細胞對Notch信號通路的阻斷劑可能更加敏感［38］。GSIs通過阻斷 Notch信號通路，降低增殖，增加AKT、STAT3磷酸化降低導致的凋亡，降低標記有CD133、nestin、Bmi1和Olig2的膠質母細胞瘤干細胞的生存率。

3.1.4 SCF-/c-KIT信號途徑 干細胞因子(stem cell factor，SCF)又稱為KIT配體，是由骨髓微環境中的基質細胞產生的一種酸性糖蛋白。相對于非腫瘤細胞，CSCs表達c-KIT并分泌SCF。SCF與其他細胞因子一起誘導干/祖細胞動員、增殖，延長其存活時間。Levina等［39］發現在非小細胞肺癌細胞系中CSCs具有高致瘤性、高轉移和惡性度高的特性，這與其高效的細胞因子網絡和特定的信號通路有關，阻斷SCF-c-KIT信號能夠抑制由化療引起的CSCs增殖和存活，提示抑制SCF-c-KIT信號可能會提高非小細胞肺癌化療的療效。

除此之外，Funayama等［40］將白血病細胞系TF-1和間質細胞MS-5共培養后，產生了類似于白血病CSCs niche的一個區域，使得白血病CSCs對阿糖胞苷、依托泊苷和柔紅霉素的耐藥性增強。白血病CSCs耐藥性的增強主要是通過增加細胞在G0/G1期的比例，促進細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白的上調以及增加Bcl-2的水平，而不影響BAX或者藥物轉運蛋白ABCG2和ABCB1的表達。纖維連接因子受體VLA-4(α4β1整和素)的抗體能夠阻斷腫瘤細胞和轉移niche的聯系［41］，并且在急性白血病模型中能夠降低微小殘留病灶的發生率。含大量透明質酸的底物能夠保護造血干細胞抵抗5-Fu的細胞毒作用，而抗CD44抗體能夠減少急性白血病模型中微小殘留病灶［42］。因此，細胞外基質蛋白和葡糖胺聚糖能夠影響干細胞的特性，可用于抗CSCs治療。

3.2 ABC轉運蛋白 人類基因組包含49種ABC轉運蛋白基因(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)，其中P-糖蛋白(P-gp/ABCB1)、乳腺癌耐藥相關蛋白(BCRP/ABCG2)、ABCA3和多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance associated proteins，MRPs)與腫瘤細胞的多藥耐藥有關。ABC基因家族的過表達是保護干細胞的主要機制之一，早先發現P-gp的耐藥機制與細胞對藥物攝入量的減少有關，而攝入的減少是由一種能量依賴性的主動外排機制引起的。研究證實［43］ABCG2與SP細胞的干細胞成分直接相關;過表達BCRP的不同細胞系也表現出對一系列抗癌藥物的耐藥性。CSCs可能原發性地對許多標準治療不敏感，并且能夠在細胞毒藥物和靶點藥物治療后存活，最終導致腫瘤復發。另外，ABC轉運蛋白可能通過外排重要的轉錄因子和細胞分化因子來調節干細胞的活動［44］。表達 BCRP和 P-gp的CSCs能特異性外排化療藥物，從而導致耐藥。其中，表達P-gp的CSCs能外排長春堿和紫杉醇，而表達BCRP的CSCs能抑制伊馬替尼、拓撲替康和甲氨蝶呤的積累。朱言亮等通過對人肺腺癌細胞株SPC-A1及其多西他賽耐藥株SPC-A1/ Docetaxel兩者的SP細胞的含量及其生物學特性、ABC轉運蛋白的表達及其對多西他賽耐藥性影響的比較，發現SPCA1-SP細胞基本具備了腫瘤干細胞的特性，而且BCRP表達也是SPC-A1-SP細胞多西他賽耐藥的一個主要因素。Sung等［45］也發現ABCG2表達對肺A549細胞系SP表型的多藥耐藥起重要作用。白血病的SP細胞里富集CSCs，具有很強的將化療藥物如多柔比星和米托蒽醌泵出細胞的能力，提示增強的藥物外排能力可導致白血病CSCs耐藥。成神經瘤CSCs也能外排米托蒽醌，故其存活率高于成神經瘤細胞［46］。

總之，ATP轉運依賴性的CSCs在形成腫瘤時相對普遍存在，將來應考慮聯合應用其它識別和針對CSCs的靶向藥物進行聯合化療。表2為ABC家族在腫瘤干細胞樣細胞中表達情況及其底物的簡要總結歸納(見Comment in The ABC of glycosylation.［Nat Rev Cancer.2010］)。

3.3 DNA修復 在自我更新或者DNA修復的過程中，干細胞可能通過減少細胞凋亡或者產生基因突變對化療產生耐藥性，因此導致化療耐藥和治療失敗。腫瘤干細胞樣細胞具有更強的DNA修復能力。DNA修復蛋白O6-methyl guanine-DNA methyltrans-ferase(MGMT)也稱為O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase(AGT)，能夠恢復6-氧烷基鳥嘌呤堿基結構的完整性，因此能抵抗6-氧烷化劑的細胞毒性。神經膠質瘤中MGMT表達水平的增加與卡莫司汀和替莫唑胺耐藥密切相關。神經膠質瘤中CD133+的SP細胞中，MGMT的表達較CD133-細胞高出30多倍，導致對替莫唑胺的耐藥性增強［47］。

在膠質母細胞瘤干細胞樣細胞中，抑制MEK能夠降低MDM2的表達，而在抑制MEK或者MDM2時導致p53的激活，同時伴有依賴于p53的MGMT表達的下調;另一方面，抑制MEK能恢復耐藥的膠質母細胞瘤干細胞樣細胞對替莫唑胺的敏感性，MEK抑制劑與替莫唑胺聯合用藥時能有效地抑制膠質母細胞瘤干細胞樣細胞的致瘤能力。由此推斷靶向MEK-ERK-MDM2-p53通路聯合應用替莫唑胺將會是一種新的有前途的治療策略［48］。

Tab 2 Selected ABC transporters，their expression in CSCs and chemotherapeutics

Fig 2 Cancer stem cell pathway-derived chemoresistance

3.4 其他機制 其他機制也參與調節CSCs的耐藥性。例如CD133+的結腸癌CSCs細胞中白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)表達上調，導致凋亡減少，而用抗體阻斷IL-4后使對氟尿嘧啶和奧沙利鉑耐藥的結腸CSCs重新變得敏感［49］。

肺癌CSCs中Hsp27在應用過氧化物和傳統化療之后活性增加，而用化療藥物的同時阻斷Hsp27的表達會降低原本對傳統化療耐藥的肺CSCs的存活率，表明Hsp27是導致肺CSCs耐藥的重要原因［50］。Hermann等［51］在胰腺癌中發現CD133+的CSCs具有高致瘤性，對標準化療方案很高的耐藥性。Ma等［52］認為肝細胞癌的CSCs通過表達AKT/PKB通路相關的生存蛋白從而對多柔比星和氟尿嘧啶產生耐藥。神經膠質瘤CSCs對替莫唑胺、卡鉑、依托泊苷和紫杉醇耐藥，其機制可能是通過高表達BCRP、MGMT、抗凋亡蛋白以及凋亡蛋白家族抑制劑［53］。在白血病CSCs中分子代謝調節劑ALDH1活性增加，導致對環磷酰胺等化療藥物的耐藥，而在乳腺癌CSCs中ALDH1的表達與預后較差明顯相關，提示CSCs對化療藥物的耐藥機制會直接影響病人的預后。急、慢性髓性白血病CSCs處于相對靜止的狀態，而化療對處于增殖期的細胞更敏感。此外，CSCs的不對稱性分裂紊亂可能導致腫瘤細胞過度增殖和耐藥。

4 結語與展望

CSCs具有自我更新的特性，其自我更新過程的失調很可能是腫瘤發生的原因。只有消除CSCs才有可能解決腫瘤治療的耐藥問題，提高療效，達到治愈腫瘤的目的。目前無論是傳統的化療還是現有的靶向治療措施尚無法徹底清除CSCs，以致發生耐藥和腫瘤復發，因此，清除CSCs及其依賴的信號傳導通路已成為預防耐藥的一個重要方向。雖然對CSCs的研究還處于初級階段，但干細胞理論開闊了治療腫瘤、預防耐藥的思路，對于腫瘤治療的基礎理論研究的深入拓展和臨床實踐都具有積極的意義。

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