體外法篩選α-淀粉酶和糖化酶的最佳組合研究

由大鵬賈紅梅黃慧敏劉艷玲

(1.通遼市農(nóng)牧業(yè)局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，內(nèi)蒙古通遼028000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010010；3.烏蘭察布市委黨校，內(nèi)蒙古集寧012000；4赤峰市林西縣畜牧局，內(nèi)蒙古林西025250)

酶制劑作為一種飼料添加劑，其能分解飼糧中的抗?fàn)I養(yǎng)因子,提高飼料養(yǎng)分的消化吸收率已經(jīng)被廣大飼料生產(chǎn)企業(yè)所認(rèn)同。但酶制劑作為一種應(yīng)用條件很高的工業(yè)化產(chǎn)品，由于菌種、發(fā)酵底物及發(fā)酵條件等諸多差異導(dǎo)致其酶學(xué)質(zhì)量參差不齊。體內(nèi)法和體外法是評(píng)定酶制劑的兩種方法，體內(nèi)法受其周期長(zhǎng)、繁瑣、影響因素多的影響，而體外法所表現(xiàn)出的快速、重復(fù)性好、易操作的優(yōu)勢(shì)，成為酶制劑產(chǎn)品在投放市場(chǎng)之前進(jìn)行快速有效的篩選和評(píng)定手段。

α-淀粉酶和糖化酶已被飼用酶制劑生產(chǎn)企業(yè)推廣投放到市場(chǎng)，但應(yīng)用體外法對(duì)這兩種酶制劑的研究報(bào)道卻十分鮮見。本試驗(yàn)應(yīng)用體外法研究不同水平α-淀粉酶和糖化酶對(duì)玉米、小麥及全價(jià)日糧中的體外消化率，篩選出其在復(fù)配過程中的最適宜添加量組合，為家禽日糧中添加這兩種酶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 酶制劑

α-淀粉酶（2 000 IU/g）、糖化酶（150 000 IU/g），由肇慶市華芬飼料酶有限公司提供。

1.2 酶解樣品

玉米（內(nèi)蒙古土左旗）、小麥（內(nèi)蒙古林西縣）、0～3周齡肉雞全價(jià)日糧，均過60目篩。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

采用3×3兩因子析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)，添加量及分組情況見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組情況

1.4 離體模擬消化過程

離體消化試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[1-4]介紹的方法，并根據(jù)實(shí)際需要做了相應(yīng)調(diào)整。

1.4.1 胃消化階段

準(zhǔn)確稱取1 g（＜1 mm）飼料樣品(精確至0.1 mg)，置于150 ml錐形瓶中，向錐形瓶中加入15 ml磷酸緩沖液（0.2 M，pH值6.0），小心混合均勻后，加入10 ml 0.2 M HCl溶液，將食糜pH值調(diào)至2.5（1 M HCl或1 M NaOH），并記錄所加溶液體積（800 μl），然后加入胃蛋白酶溶液1.0 ml，再加入新鮮的糖化酶和淀粉酶的鹽酸混合溶液2.0 ml（9個(gè)水平），調(diào)節(jié)pH值至2.5，并記錄所加溶液體積（200 μl），用膠塞封口。將錐形瓶于40℃恒溫水浴搖床中（120次/min），5 min后開始計(jì)時(shí)，消化4 h。

1.4.2 小腸消化階段

待胃消化階段結(jié)束后，向食糜中加入10 ml磷酸緩沖液(0.2 M、pH值6.8)和5 ml 0.6 M的NaOH溶液,調(diào)整食糜pH值至7.0,再加入新鮮的胰蛋白酶溶液1.0 ml,并使pH值仍保持6.8，記錄所加溶液體積（μl）。用膠塞封口后，于40℃恒溫水浴搖床中（120次/min），放入5 min后開始計(jì)時(shí)，繼續(xù)消化4 h。

1.4.3 測(cè)定指標(biāo)

1.4.3.1 還原糖生成量

消化結(jié)束后，將消化液冷卻靜置，取上清液離心后，再用移液管移取離心管消化液1.0 ml，并加入1.0 ml蒸餾水到相對(duì)應(yīng)試管中，然后加入3.0 ml DNS試劑搖勻，在沸水中煮沸5 min，然后放入冰水浴中冷卻以終止顯色反應(yīng)，540 nm下測(cè)定酶樣吸光值(以等容無(wú)糖DNS試劑空白做對(duì)照)，折算出還原糖生成量。

1.4.3.2 干物質(zhì)消化率和離體消化能

在消化殘?jiān)屑尤?2 ml磺基水楊酸(濃度10%),于室溫放置30 min，最后將殘?jiān)B同己知重量的無(wú)氮濾紙置于105℃烘箱中烘至恒重，用能量測(cè)定儀Parr 1281測(cè)定能值，分別計(jì)算出干物質(zhì)消化率和離體消化能。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SAS9.0軟件進(jìn)行二因素方差分析，并對(duì)各組多重比較（Duncan's法），觀察顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶和糖化酶對(duì)還原糖生成量的影響(見表2)

表2 α-淀粉酶和糖化酶對(duì)還原糖生成量的影響(mg/g)

由表2可知：隨著α-淀粉酶和糖化酶添加量的提高，3種原料組的還原糖生成量也相應(yīng)出現(xiàn)不程度地增加(P＜0.01)，而且α-淀粉酶和糖化酶在酶解過程中存在明顯協(xié)同作用(P＜0.05),在玉米組中,處理6組的還原糖生成量數(shù)值上極顯著高于其他組(9組除外)(P＜0.01),在小麥組中,處理8組極顯著高于其他組(9組除外)(P＜0.01),從全價(jià)日糧上看,處理6組也極顯著高于其它組(9組除外)(P＜0.01)。

2.2 α-淀粉酶和糖化酶對(duì)干物質(zhì)消化率的影響（見表3）

表3 α-淀粉酶和糖化酶對(duì)干物質(zhì)消化率的影響（%）

由表3可知，隨著2種酶添加量的提高，3種物質(zhì)的干物質(zhì)消化率也相應(yīng)出現(xiàn)不同程度地增加,而且α-淀粉酶和糖化酶在酶解過程中存在不同程度的協(xié)同互作效應(yīng)（P＜0.05），在玉米組中,處理5組、6組、8組、9組的干物質(zhì)消化率數(shù)值上明顯高于其余組（P＜0.05），在小麥組中,處理6組干物質(zhì)消化率明顯高于其他組（8組除外）（P＜0.01），從全價(jià)日糧上看,處理6組也明顯高于其他組（9組除外）（P＜0.01）。

2.3 α-淀粉酶和糖化酶對(duì)離體消化能的影響（見表4）

表4 α-淀粉酶和糖化酶對(duì)離體消化能的影響（MJ/kg）

由表4可知：隨著α-淀粉酶和糖化酶添加量的提高，3種原料的離體消化能相應(yīng)出現(xiàn)不程度地增加(P＜0.01),且在酶解過程中存在不同程度的協(xié)同互作效應(yīng)(P＜0.05)，在玉米組中，處理6組、8組的離體消化能高于其余組(P＜0.05)；在小麥組中，處理6組(處理8組除外)離體消化能高于其余組(P＜0.05)，在全價(jià)日糧組中，處理6組的離體消化能高于其它組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 添加α-淀粉酶和糖化酶的必要性

近十幾年來(lái)，有關(guān)酶制劑能提高動(dòng)物的日糧利用率、促進(jìn)動(dòng)物消化道健康發(fā)育的科學(xué)研究報(bào)道很多，尤其在單胃動(dòng)物日糧中的應(yīng)用非常普遍，但各種酶制劑產(chǎn)品因發(fā)酵菌種、底物及發(fā)酵條件的不同而使用效果不一。玉米和小麥作為單胃動(dòng)物主要的能量飼料來(lái)源，可占到全價(jià)配合日糧配比的30%～70%，所以調(diào)控玉米和小麥在體內(nèi)的利用率，才是當(dāng)今酶制劑生產(chǎn)商亟待解決的重要問題。

劉濤(2005)[5]指出,飼料原料中只有82%的淀粉可以被消化,未消化的淀粉進(jìn)入大腸發(fā)酵,產(chǎn)生VFA,被吸收進(jìn)入體內(nèi)提供能量,但這不能完全釋放其能量,這就需要外源酶提高其能量利用率。外源性α-淀粉酶和糖化酶正好彌補(bǔ)內(nèi)源酶分泌不足,盡可能最大限度地消化淀粉,從而減少后腸發(fā)酵,最終減少能量損失。在本試驗(yàn)中,添加α-淀粉酶和糖化酶不同程度的提高玉米、小麥、全價(jià)日糧的體外消化率(P＜0.05),釋放可溶性還原糖,提高了其離體消化能；在體外酶解過程中,3個(gè)測(cè)定指標(biāo)并不是隨著α-淀粉酶和糖化酶添加量的提高而直線增加,而是出現(xiàn)了拐點(diǎn),從結(jié)果上看,處理6組和8組的各指標(biāo)要高于其他處理組(P＜0.05),這也驗(yàn)證了酶與底物之間作用存在高效性,同時(shí)說(shuō)明單胃動(dòng)物日糧中添加α-淀粉酶和糖化酶是必要可行的。

3.2 α-淀粉酶和糖化酶的協(xié)同作用效果研究

在適宜條件下，α-淀粉酶能切開淀粉鏈內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖；而糖化酶除了能從淀粉鏈的非還原性末端切開α-1，4糖苷鍵，也能緩慢切開α-1，6糖苷鍵，它能很快地把直鏈淀粉從非還原性末端依次切下葡萄糖單位。

基于以上作用機(jī)理，姚衛(wèi)蓉等(2005)[6]的試驗(yàn)結(jié)果表明，α-淀粉酶和糖化酶水解淀粉存在很好的協(xié)同作用。張劍等(2007)[7]報(bào)道，α-淀粉酶和糖化酶間的互作效應(yīng)要優(yōu)于單酶的水解效果。李富偉等(2009)[8]研究也得出，pH值4.6條件下淀粉酶與糖化酶的互作效應(yīng)明顯。本試驗(yàn)?zāi)M胃腸道內(nèi)環(huán)境，采用兩步離體消化法，對(duì)3種樣品進(jìn)行離體酶解測(cè)定的結(jié)果表明：α-淀粉酶和糖化酶在酶解3種底物時(shí)存在明顯的協(xié)同互作效應(yīng)（P＜0.05），這與上述的報(bào)道結(jié)果是一致的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用胃蛋白酶-胰酶兩步水解法，探討玉米、小麥及全價(jià)日糧中的體外消化情況，結(jié)果表明，各組還原糖生成量、干物質(zhì)消化率、離體消化能均隨α-淀粉酶和糖化酶添加量的增加都有不同程度的提高（P＜0.05），且這兩種酶制劑之間存在明顯協(xié)同互作效應(yīng)（P＜0.05）。綜合添加成本等因素考慮，α-淀粉酶和糖化酶在玉米、小麥和全價(jià)日糧中的最適添加量分別為500 μg/g和750 μg/g、1 000 μg/g和500 μg/g、500 μg/g和750 μg/g。

[1] 張鐵鷹,汪儆.單胃動(dòng)物體外消化模擬技術(shù)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2005(2):1-8.

[2] 王前光,賀建華,劉朝干,等.體外酶解法評(píng)定酶制劑的應(yīng)用[J].飼料研究,2006(4):56-58.

[3] 侯小鋒.非淀粉多糖酶制劑對(duì)肉仔雞日糧能量代謝率的調(diào)控及其體外評(píng)定方法的研究[D].山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

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[5] 劉濤.酶制劑及其底物的研究進(jìn)展[A].酶制劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用,2005:71-78.

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[7] 張劍,張開誠(chéng),田輝.混合酶水解水溶性淀粉的研究[J].中國(guó)釀造,2007(2):23-26.

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