轉氨酶催化不對稱合成芳香族L-氨基酸

夏溫娜，孫雨，閔聰，韓威，吳勝

1 沈陽藥科大學生命科學和生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016

2 中國科學院微生物研究所 微生物資源前期開發國家重點實驗室，北京 100101

氨基酸是組成蛋白質的基本結構單元。在組成蛋白質的20種天然氨基酸中，除甘氨酸外，其他都是L-型的手性α-氨基酸。相對于L-型氨基酸的廣泛存在，研究人員從微生物和高等生物中也分離到許多以游離或結合形式存在的 D-型氨基酸[1-3]，這些 D-型氨基酸在生長發育、代謝調控等許多方面發揮著重要的作用[4-5]。從結構來看，含有芳香環的氨基酸具有獨特的化學和生物學性質，在食品、醫藥和化工行業都有很廣泛的應用。常見的芳香族氨基酸有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、苯甘氨酸、對羥苯甘氨酸等。L-苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，也是目前食品行業普遍使用的甜味劑阿斯巴甜 (Aspartame) 的主要生產原料[6]。L-酪氨酸是合成二溴酪氨酸、二碘酪氨酸及L-多巴、腎上腺素等醫藥產品的手性砌塊，同時也可以作為氨基酸類藥物治療脊髓炎和結核腦炎等疾病[7-8]。苯甘氨酸和對羥苯甘氨酸則是合成青霉素類和頭孢菌素類藥物的重要手性砌塊[9]。這些天然和非天然的手性氨基酸也是多肽固相合成的重要原料[10]。

L-氨基酸可以通過直接發酵法、化學合成法和生物酶法等多種方法進行生產。在微生物體內，天然氨基酸的合成都是利用葡萄糖經過復雜的代謝途徑合成的，通過代謝工程改造這些生物合成途徑來提高目標氨基酸的合成效率是重要的研究方向[11-13]。常規化學合成的氨基酸都是外消旋體，需要進一步通過手性拆分試劑將外消旋體中的兩個對映體分離從而獲得單一異構體。通過不對稱化學合成手性氨基酸是目前有機合成領域的重點研究方向，在金屬催化劑和有機催化劑的設計和應用方面取得很多進展[14-15]。相對于化學不對稱催化，生物不對稱催化具有許多獨特的優勢。酶催化通常在室溫和水相中進行，反應條件溫和；相對于化學催化劑，酶作為生物催化劑通常具有很高的催化活性以及區位和立體選擇性；酶催化省去了化學催化過程中常用的對活性功能基保護和去保護過程。通過生物不對稱氨化合成手性氨類化合物取得了重大的突破，2010年，Merck公司和Codexis公司的科研人員密切合作，利用分子改造后的ω-轉氨酶將前手性的酮經過一步生物不對稱氨化合成治療糖尿病的藥物西格列汀 (Sitagliptin)，并且實現工業化生產，為企業帶來巨大的經濟效益[16-17]。

通過生物不對稱催化合成 L-氨基酸的酶促反應的類型很多[18-20]，在眾多的酶促反應中，經由轉氨酶催化的不對稱轉氨反應合成手性 α-氨基酸具有獨特的生物學地位，轉氨酶催化的α氨基酸和酮酸之間的氨基轉移反應在氨基酸的代謝中占有重要地位。轉氨酶是 5-磷酸吡哆醛(PLP) 依賴型，其催化的反應是可逆的，在反應過程中存在5-磷酸吡哆醛 (PLP) 和5-磷酸吡哆胺 (PMP) 的互相轉換 (圖 1)。轉氨酶催化的是典型的雙底物反應，遵循乒乓反應機制[21]。通常轉氨酶具有底物的不專一特點，因此可以用一種轉氨酶合成多種類型的氨基酸。轉氨酶對作為氨基供體的不同氨基酸底物的催化活性不同，命名主要是根據其催化活力最大的氨基酸來命名，比如天冬氨酸轉氨酶和苯丙氨酸轉氨酶的氨基供體最適底物分別為天冬氨酸和苯丙氨酸。通過轉氨酶合成手性氨基酸是酶促不對稱催化合成氨基酸的一種重要的途徑[22-26]。

圖1 轉氨酶催化的生物不對稱氨化合成氨基酸Fig. 1 Biosynthesis of amino acids by asymmetric transamination catalyzed by aminotransferase.

本文通過對不同來源轉氨酶的進化分析，選擇分別源自原核生物 E. coli和真核生物S. cerevisia具有代表性的Ⅰ型轉氨酶TyrB和Aro8進行研究，轉氨酶TyrB和Aro8的生物學功能和基本的酶學性質已有較為詳細地研究[27-29]，本文重點探索兩酶通過逆轉平衡反應不對稱合成芳香族氨基酸的效率。首先克隆了兩酶的編碼基因并過量表達純化，對轉化生成的氨基酸進行了手性 HLPC檢測。詳細比較研究了兩酶在催化 α-酮酸合成天然和非天然芳香族 L-氨基酸的反應過程和催化效率，測定了兩酶在制備規模條件下合成芳香族氨基酸的轉化率和比生產速率。結果表明兩酶都可以有效地合成芳香族氨基酸。在生物不對稱氨化合成非天然苯甘氨酸時，轉氨酶Aro8較TyrB催化效率更高，比生產速率是后者的2.2倍；在合成天然氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸時，兩酶的催化效率相近。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工具酶與試劑

限制性內切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購于加拿大MBI Fermentas公司；IPTG購于北京賽百盛基因技術有限公司；苯甲酰甲酸、4-羥苯丙酮酸購于比利時ACROS試劑公司；苯丙酮酸購于美國 Sigma-Aldrich公司；L-苯甘氨酸購于北京偶合科技有限公司，L-酪氨酸、D-丙氨酸、L-丙氨酸購于國藥集團化學試劑北京有限公司；基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒購于天根生化科技 (北京) 有限公司；丙烯酰胺、DNA凝膠回收試劑盒購于德國QIAGEN公司；丙烯酰胺、N,N’-亞甲叉丙烯酰胺、TEMED購于美國 AMRESCO公司；蛋白胨、酵母膏、氯化鈉均為國產分析純試劑。

1.1.2 菌株與質粒

釀酒酵母S. cerevisiae購于中國普通微生物菌種保藏管理中心 (CGMCC)。E. coli DH5α、E. coli BL21 (DE3) 與表達載體pET-28a、pET-30a均為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 轉氨酶基因的克隆、表達與純化

原核微生物 E. coli DH5α和真核微生物S. cerevisiae分別接種到LB和麥芽汁培養基中，分別在37 ℃和28 ℃培養14 h，離心收集菌體?；蚪MDNA的提取按照基因組提取試劑盒指示的方法進行。通過對S. cerevisiae基因組的生物信息學分析表明編碼轉氨酶Aro8的基因aro8中無內含子的存在，因此對基因 aro8的克隆直接用S. cerevisiae基因組DNA為模板，無需提取總mRNA，通過逆轉錄PCR進行。根據NCBI數據庫中E. coli中tyrB基因序列 (GenBank Accession No. M12047) 和S. cerevisiae中aro8基因序列(GenBank Accession No. Y13624) 分別設計上游引物和下游引物，見表1。

表1 用于擴增tyrB和aro8基因的PCR引物Table 1 PCR primers for amplification of tyrB and aro8 genes

分別以E. coli和S. cerevisiae基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR的條件為：94 ℃5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，進行30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物切膠回收后，分別用NdeⅠ/XhoⅠ以及NdeⅠ/BamHⅠ雙酶切，連接到經同樣酶切處理的表達載體pET-30a和 pET-28a，構建重組質粒 pET30-tyrB 和pET28-aro8，轉化宿主E. coli BL21 (DE3)。菌落PCR，酶切驗證以及序列測定表明克隆的基因序列與數據庫中的序列一致，并且正確地連接到表達載體的讀碼框中。

含有表達質粒的重組大腸桿菌接種到LB液體培養基中，加入終濃度為10 mg/L卡那霉素，37 ℃、200 r/min培養至OD580等于0.8左右時，加入誘導劑IPTG，終濃度為1 mmol/L。轉移到28 ℃搖床中，200 r/min繼續誘導培養6 h。離心收集的菌體用PBS緩沖液洗滌后，加入破碎緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑) 懸浮菌體，在冰浴條件下超聲破碎細胞，低溫高速離心 (12 000 r/min，25 min)收集上清液，將收集的樣品加到預先處理過的His-Trap鎳離子螯合柱，然后以高濃度的咪唑緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑) 進行洗脫，收集的目的蛋白在PBS緩沖液中透析脫鹽后，分裝凍存于-80 ℃保存備用。

1.2.2 蛋白質濃度測定和電泳檢測

蛋白濃度采用紫外分光光度法，應用日本Malcom公司的e-spect測定。SDS-PAGE進行蛋白檢測時，濃縮膠濃度為 5%，分離膠濃度為10%。電泳完畢分離膠用考馬斯亮藍R250染色，脫色后觀察蛋白質的表達和純化效果。

1.2.3 轉氨酶的活性測定

無特別說明時，轉氨酶活力測定的1 mL反應體系中包含 100 mmol/L 磷酸鹽緩存液(pH 8.0)，1 mmol/L α-酮酸 (氨基受體)，4 mmol/L L-丙氨酸 (氨基供體)，0.1 mmol/L PLP，以及一定量的轉氨酶。30 ℃、1 000 r/min反應20 min (處于一級反應范圍之內)。芳香族酮酸和氨基酸的檢測和定量按1.2.5中所示的HPLC法進行測定。酶活的定義：轉氨酶在上述實驗條件下每分鐘催化生成1 μmol氨基酸定義為1個活力單位 (U)。酶的比活力定義為每毫克純的轉氨酶每分鐘催化生成氨基酸的微摩爾數。

1.2.4 制備規模的生物不對稱轉氨合成芳香族氨基酸

為了比較規?；苽溥^程中，兩種酶 (Aro8和TyrB) 催化不對稱氨化3種不同的α-酮酸生成相應的芳香族L-氨基酸的最大生產效率，反應體系中苯丙酮酸和 4-羥苯丙酮酸的濃度為各自的飽和濃度，濃度分別為23 mmol/L和27 mmol/L，兩種酮酸在水相中的溶解度與其是否成鹽以及成鹽的類型有關[30]。苯甲酰甲酸的濃度為 Aro8和 TyrB各自的最適底物濃度 (20 mmol/L和10 mmol/L)。反應體系中氨基供體L-丙氨酸的濃度為α-酮酸濃度的4倍，PLP濃度是0.1 mmol/L，用0.5 mol/L NaOH調節反應液pH為8.0，加入轉氨酶后啟動反應。反應體系總體積為40 mL，反應溫度為30 ℃，轉速為1 000 r/min。在反應過程中定時取樣，用HPLC定量檢測殘留的酮酸和生成的芳香族氨基酸。

1.2.5 分析方法

轉氨反應結束后，反應液經高速冷凍離心和微孔濾膜過濾處理，芳香族酮酸和生成氨基酸的定性和定量分析在HPLC上進行，定量采用標準曲線法。常規 HPLC分析色譜柱為Dikma C18反向色譜柱，柱溫為室溫25 ℃。流動相A液為50 mmol/L KH2PO4+2%乙腈，B液為色譜級乙腈。分離苯甲酰甲酸及其產物時，A液和B液的比例為94∶4，苯甘氨酸和苯甲酰甲酸的保留時間分別為3.8 min和10.5 min；分離苯丙酮酸及其產物時，A液和B液的比例為90∶10，苯丙氨酸和苯丙酮酸的保留時間分別為3.8 min和10.2 min；分離4-羥苯丙酮酸及其產物時，A液和B液的比例為98∶2，酪氨酸和 4-羥苯丙酮酸的保留時間分別為 4.2 min和7.9 min。

芳香族氨基酸在進行手性分析時，色譜柱為Chirex 3126(D)-pheicillamine 手性柱，A 液為2 mmol/L CuSO4溶液；B液為色譜級甲醇。分離DL-苯丙氨酸和DL-苯甘氨酸時，A液和B液的比例為 75∶25；分離 DL-酪氨酸時，A液和 B液的比例為85∶15。分離過程中保持色譜柱的柱溫為35 ℃。各種芳香族氨基酸對映體的保留時間見圖5。轉化率指反應過程中消耗底物酮酸的量與反應前加入總的底物酮酸量的比例。比生產速率指在實驗條件下，每小時每克純的轉氨酶催化生成氨基酸的產量 (g/(g·h))。

2 結果與分析

2.1 轉氨酶的進化分析

圖2 轉氨酶系統進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of aminotransferases from different sources. Groups I-IV are shaded and labeled. Bootstrap values are given on the relevant branches of the tree. HisPAT from Burkholderia rhizoxinica HKI 454(CBW74631); DAPAT from Simkanina nogevensisz (YP_004671405); TyrB from E. coli (AAA24703); AlaAT from Haemophilu shaemolyticus HK386 (EIJ73959.1); TyrAT from Bos taurus (DAA20108); AspAT from Methanococcus jannaschii (D64385); ARO9 from S. cerevisiae (NP_012005); ARO8 from S. cerevisiae (CAA73946); KynAT from Bos taurus (DAA27093.A); AcornAT from Corynebacterium jeikeium K411 (CAI37006); AGAT from Bos taurus (DAA17829); PutAT from E. coli BL21 (CAQ33409); OrnAT from Mus musculus (NP_058674); AIBAT from Actinoplanes sp. SE50/110 (YP_006266630); GaBaAT from Bacillus amyloliquefaciens Y2 (AFJ60460); Beta-AlaAT from Pseudomonas fluorescens A506 (AFJ59042); Omga-AlaAT from Burkholderia rhizoxinica HKI 454 (CBW76658); LysAT from Mycobacterium sp. (AFJ37069); PSerAT from Bartonella tribocorum CIP 105476 (CAK01014); AEPAT from Vibrio cholerae IEC224 (AFC60092); SerAT from Homo sapiens (CAA39572); D-AlaAT from Staphylococcus carnosus subsp. carnosus (CAL28261); BcaaAT from Methanocella conradii HZ254 (AFC98904).

將文獻報道的不同來源的轉氨酶的蛋白質序列進行比較和聚類分析，可以將轉氨酶分為4類 (圖2)。己報道的轉氨酶都是以5-磷酸吡哆醛(PLP) 為輔基，催化同一類型的反應，它們之間的主要區別就在于轉氨酶的底物特異性 (此處的底物主要指氨基供體，即氨基酸) 不同。每一類型的氨基轉移酶的底物結構類似。第Ⅰ類氨基轉移酶是4種類型中數量較多的一類，這類酶作用的底物較多，存在底物交叉現象，比如天冬氨酸轉氨酶 (AspAT) 和酪氨酸轉氨酶 (TyrAT)都能催化苯丙氨酸的轉氨反應。第Ⅳ類轉氨酶包含比較少見的D-型氨基酸轉氨酶如D-丙氨酸轉氨酶 (D-AlaAT) 等。在本研究旨在通過生物不對稱催化氨化合成芳香族L-氨基酸，因此選擇Ⅰ型轉氨酶中具有代表性的兩個芳香族氨基酸氨基轉氨酶Aro8和TyrB，兩者分別來源于真核生物S. cerevisiae和原核生物E. coli。芳香族氨基酸轉氨酶的最適氨基供體底物是苯丙氨酸和酪氨酸等，氨基受體為丙酮酸或α-酮戊二酸。本研究中是基于轉氨酶可以催化可逆反應，探索利用較為廉價的丙氨酸或谷氨酸為氨基供體，通過逆轉化學反應平衡從而逆向合成具有重要用途的天然和非天然芳香族氨基酸的反應過程和催化效率。

2.2 轉氨酶的克隆、表達和純化

根據 NCBI數據庫中來源于 E. coli 和S. cerevisiae的轉氨酶TyrB和Aro8的基因序列分別設計引物tyrB for和tyrB rev以及aro8 for和aro8 rev。以各自的基因組為模板進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小分別約為1 200 bp和1 700 bp (圖3)。進一步通過常規的分子生物學操作分別構建重組表達載體pET28-aro8和pET30-tyrB。轉化E. coli BL21 (DE3) 后獲得正確的重組菌。重組菌經IPTG誘導后，重組蛋白在大腸桿菌中得到高水平的可溶性表達。重組的轉氨酶Aro8和TyrB分別在N末端和C末端含有6個His-Tag，能夠特異性地結合到帶有鎳離子的親和層析柱上，破碎后的粗蛋白經過親和純化之后，得到純度較高的目的蛋白。經過10%的SDS-PAGE電泳顯示，Aro8的蛋白分子量約為57 kDa，TyrB的蛋白分子量約為44 kDa (圖4)。

圖3 aro8和tyrB基因PCR產物電泳圖Fig. 3 Ananlysis of PCR products of aro8 and tyrB gene. M: DNA marker; 1: aro8 PCR product; 2: tyrB PCR product.

圖4 SDS-PAGE分析純化的轉氨酶Aro8和TyrBFig. 4 SDS-PAGE analysis of the purified aminotransferases. M: protein molecular marker; 1: purified Aro8; 2: purified TyrB.

2.3 轉氨酶活力

如表2所示，以L-丙氨酸為氨基供體，轉氨酶Aro8和TyrB催化α-酮酸合成芳香族氨基酸苯甘氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸時，以4-羥苯丙酮酸為底物時，催化活力最大，苯丙酮酸次之，苯甲酰甲酸為底物催化活力最低。催化苯甲酰甲酸轉氨生成苯甘氨酸時，來自S. cerevisiae的轉氨酶Aro8是來自E. coli的TyrB催化活力的5.6倍。底物芳香族 α-酮酸中芳香環上的取代基以及脂肪酸碳鏈部分的長度都對酶催化的轉氨效率有顯著的影響。

表2 轉氨酶TyrB和Aro8轉氨合成芳香族氨基酸的活力Table 2 Aromatic transamination activity of Aro8 and TyrB

2.4 轉氨酶催化生成芳香族氨基酸的構型分析

轉氨酶能夠催化將氨基酸的氨基轉移到 α-酮酸上，α-酮酸發生不對稱氨化生成相應的氨基酸。在轉氨過程需要輔酶PLP與氨基酸結合形成復合物，通過內源性醛亞胺與外源性醛亞胺之間的互換完成氨基的轉移。本實驗以苯甲酰甲酸、苯丙酮酸、4-羥苯丙酮酸作為氨基的受體，以L-丙氨酸作為氨基供體，在轉氨酶TyrB和Aro8的作用下形成相應的苯甘氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。氨基受體濃度為 1 mmol/L，L-丙氨酸為2 mmol/L，PLP為0.1 mmol/L，體系中轉氨酶的量為 0.3 mg。經過 12 h的反應后產物經手性HPLC檢測，發現生成的氨基酸構型均是L型，e.e值等于100% (圖5)。這表明轉氨酶Aro8和TyrB催化的轉氨反應具有絕對的立體選擇性，可以用來合成光學純的L-氨基酸。

2.5 氨基供體的選擇

Aro8和 TyrB均為芳香族氨基酸氨基轉移酶，轉氨反應中最適的氨基供體是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等。本研究是利用轉氨酶催化反應的可逆性通過逆轉化學反應平衡從而逆向合成芳香族氨基酸。本研究選擇芳香族的α-酮酸作為氨基受體，選擇比較廉價的氨基酸如L-丙氨酸和L-谷氨酸作為氨基供體，為了比較不同氨基供體對轉化率的影響，以苯丙酮酸為氨基受體為例，反應體系為：1 mmol/L苯丙酮酸，4 mmol/L L-丙氨酸或L-谷氨酸，0.1 mmol/L PLP，0.3 mg轉氨酶Aro8或TryB，30 ℃反應22 h，HPLC檢測生成的L-苯丙氨酸的產物量，計算轉化率，結果見表3。

圖5 手性HPLC分析轉氨酶Aro8和TyrB催化的轉氨反應生成產物的立體構型Fig. 5 Chiral HPLC analysis of products after transamination reaction catalyzed by Aro8 and TyrB. (A) Bioconversion benzoylformic acid to L-phenylglycine by Aro8 (purple) and TyrB (blue). (B) Bioconversion phenylpyruvic acid to L-phenylalanine by Aro8 (purple) and TyrB (blue). (C) Bioconversion 4-hydroxyphenylpyruvic acid to L-tryrosine by Aro8 (purple) and TyrB (blue). Racemic DL-phenylglycine, DL-phenylalanine and DL-tyrosine in Fig. A, B and C, respectively, were showed in black.

表3 不同氨基供體轉氨效率的比較Table 3 Comparison of the transamination efficiency using L-alanine and L-glutamate as amino donors

如表3所示，L-丙氨酸和L-谷氨酸都可以作為氨基供體用于不對稱合成 L-苯丙氨酸，其中L-丙氨酸作為氨基供體生成苯丙氨酸的效率要優于L-谷氨酸。在實際應用時，L-谷氨酸不僅溶解度低，而且為酸性氨基酸，大量使用會改變反應體系的pH值，往往需要加入堿溶液調節體系的pH值，增加額外的操作步驟。所以L-丙氨酸為適宜的氨基供體。

研究中也探索了不同來源的兩種轉氨酶是否可以利用D-氨基酸作為氨基供體，如D-丙氨酸等，結果顯示無論Aro8還是TryB都不能利用D-氨基酸作為氨基供體合成芳香族氨基酸。

2.6 轉氨反應中氨基供體和受體比例的選擇

轉氨酶催化的氨基遷移反應是可逆反應，為了使反應平衡向合成芳香氨基酸的正反應方向進行，可以通過增加氨基供體與受體的比例來提高底物酮酸的轉化率。反應體系為：1 mmol/L苯丙酮酸，氨基供體L-丙氨酸濃度依次為受體的1、2、3、4、5、10倍，0.1 mmol/L PLP，0.3 mg 轉氨酶Aro8或TryB，30 ℃反應12 h，HPLC檢測生成的L-苯丙氨酸的產物量，計算轉化率，結果見圖6。

如圖6所示，隨著氨基供體L-丙氨酸濃度的增大，轉氨合成L-苯丙氨酸的效率增加。當氨基受體和供體的濃度比為 1∶10時，Aro8催化的苯丙酮酸轉化率達到 47.2%，TyrB催化轉化率達到29.2%，因此增加氨基供體的比例可以有效地提高轉化率，促進芳香族氨基酸合成。當受體與供體摩爾比超過1∶4時，盡管轉化率有所提高，但增加的幅度并不明顯，表明氨基供體的實際利用效率降低。根據提高轉化率和降低反應成本兩方面因素的考慮，轉氨反應中氨基受體和供體的適宜比例選擇為1∶4。

圖6 不同摩爾比的氨基受體和供體比例對合成轉氨反應的影響Fig. 6 Effect of the ratio of amino acceptor and donor on the transamination reaction.

2.7 苯甲酰甲酸轉化的最佳濃度

前手性的 α-酮酸苯甲酰甲酸通過不對稱轉氨反應可用合成非天然氨基酸苯甘氨酸，后者在醫藥工業上有廣泛的用途。在實際的生產過程中需要考慮反應體系中底物的投料量，底物濃度太稀則生產過程不經濟，底物濃度過高，有可能導致底物抑制效應。在本實驗中設定苯甲酰甲酸的濃度依次為1、10、20、30、40、50、70 mmol/L，L-丙氨酸濃度為苯甲酰甲酸對應濃度的4倍，由于高濃度的苯甲酰甲酸會改變緩沖體系的 pH值，因此用0.5 mol/L NaOH調節反應體系的pH值為 8.0。反應體系中, 輔酶 PLP濃度為0.1 mmol/L，轉氨酶Aro8和TyrB的量為0.3 mg。30 ℃反應20 h后，用HPLC檢測定量生成的苯甘氨酸，計算轉化率，結果見圖7。

圖7 不同濃度苯甲酰甲酸對轉化率的影響Fig. 7 Effect of the different concentration of benzoylformic acid on the conversion rate.

由圖7可見，在一定范圍內，隨著底物苯甲酰甲酸濃度的增加，轉化率也在增加，但過高的底物濃度，導致酶的催化活性受到明顯抑制。當Aro8催化苯甲酰甲酸不對稱轉氨反應的最適底物濃度為20 mmol/L；TyrB催化最適底物濃度為10 mmol/L。

2.8 反應進程及比生產速率

按照方法1.2.4中所述，在40 mL的制備規模的反應體系中，底物苯丙酮酸和4-羥苯丙酮酸處于飽和濃度，苯甲酰甲酸分別為Aro8和TyrB的最適底物濃度，在兩酶生物不對稱催化下將L-丙氨酸的氨基轉移到酮酸上生成相應的手性芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和苯甘氨酸。反應過程中，定時取樣，HPLC定量檢測酮酸和生成氨基酸的變化，繪制轉化反應的進程曲線 (圖8和圖9)。

圖8 Aro8催化不同底物的反應進程圖Fig. 8 Bioconversion of the different substrates using transaminase Aro8.

圖9 TyrB催化不同底物的反應進程圖Fig. 9 Bioconversion of the different substrates using transaminase TyrB.

從圖8和圖9可見，Aro8 和TyrB催化不對稱轉氨反應合成手性芳香族氨基酸的效率都是4-羥苯丙酮酸＞苯丙酮酸＞苯甲酰甲酸。Aro8催化酪氨酸、苯丙氨酸和苯甘氨酸 3種芳香族氨基酸合成的最大轉化率分別為 74%、72%和54%，比生產速率依次為0.59 g/(g·h)、0.48 g/(g·h)和0.61 g/(g·h)。轉氨酶TyrB催化上述3種氨基酸不對稱合成的最大轉化率為79%、67%和32%，比生產速率依次為 0.60 g/(g·h)、0.31 g/(g·h)和0.28 g/(g·h)。在生物不對稱氨化合成非天然苯甘氨酸時，轉氨酶Aro8較TyrB催化效率更高，比生產速率是后者的2.2倍。轉氨酶催化4-羥苯丙酮酸合成 L-酪氨酸的效率最高的原因主要是因為酪氨酸溶解度在3種芳香族氨基酸中最低，反應過程中可以觀察到生成的酪氨酸以固體的形式不斷析出，從而有效地推動反應正向進行。

就生物不催催化合成L-苯丙氨酸而言，來自酵母菌的轉氨酶Aro8的轉化效率高于來自大腸桿菌轉氨酶 TyrB以及天冬氨酸轉氨酶AspTA[31]。

3 結論

芳香族氨基酸是重要的手性砌塊，在醫藥、農業和化工行業有廣泛的用途。與微生物發酵生產天然芳香族氨基酸不同，本研究探索了利用轉氨酶具有高活性和高立體選擇性的特點，通過不對稱轉氨反應合成天然和非天然的芳香族 L-氨基酸。通過對不同來源轉氨酶的進化分析，選擇分別源自原核生物 E. coli 和真核生物S. cerevisia中的兩種具有代表性I型轉氨酶TyrB和Aro8，進行基因克隆和在E. coli BL21 (DE3)進行表達。重組轉氨酶TyrB和Aro8在大腸桿菌中獲得高水平可溶性表達。純酶活性分析表明TyrB和Aro8均能有效地催化不對稱轉氨反應合成天然和非天然的L-型芳香族氨基酸。D-型氨基酸不能作為氨基供體。反應體系中氨基供體 L-丙氨酸和氨基受體芳香族 α-酮酸的最適摩爾比為 4∶1。底物芳香族 α-酮酸中芳香環上得取代基以及脂肪酸碳鏈部分的長度都對酶催化的轉氨效率有顯著的影響。在生物不對稱氨化合成非天然苯甘氨酸時，轉氨酶Aro8較TyrB效率更高，比生產速率是后者的2.2倍；在合成天然氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸時，兩酶催化的轉氨效率相近。本研究為通過生物不對稱催化合成芳香族L-氨基酸的工業化提供了直接的實驗數據支持，同時為利用D-氨基酸氧化酶和L-轉氨酶雙酶偶聯通過去消旋化實現 D-型氨基酸轉化為 L-型氨基酸奠定了基礎。

REFERENCES

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