共轉化大腸桿菌hemA和hemL基因增強小麥過氧化物酶WP1在原核系統中的功能性表達

張超，單麗偉，蘇帥坤，南艷妮，郭忠玉，范三紅

1 西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100

2 西北農林科技大學理學院，陜西 楊凌 712100

過氧化物酶廣泛存在于植物界，它們參與植物激素代謝、細胞延伸、木質素和軟木脂形成、細胞壁組分交聯及逆境響應等重要生理及發育過程[1]。同時，植物過氧化物酶也作為重要的商品酶應用于生物催化、臨床檢測和生物技術研究等領域[2-3]。小麥種子過氧化物酶 1 (Wheat peroxidase 1，WP1) 屬于含血紅素的Ⅲ型植物過氧化物酶，其以 H2O2為電子受體催化多種芳香族化合物的氧化。該酶具有抗真菌活性，可抑制病原真菌芽管的伸長[4]；同時該酶的存在對面粉加工性能有重要影響[5-8]。利用大腸桿菌系統表達植物過氧化物酶已有一些報道，如辣根過氧化物酶HRP C、蕪青根過氧化物酶BnPA、煙草陰離子過氧化物酶TOP、楊樹細胞壁陽離子過氧化物酶CWPO_C[9-12]，但重組蛋白均主要以包涵體的形式存在，只有經過變性復性才能獲得具有部分活性的酶蛋白。本研究組曾嘗試利用大腸桿菌系統表達 WP1，雖然通過融合麥芽糖結合蛋白(MBP) 標簽實現了重組WP1的可溶性表達，但仍只能檢測到微弱的過氧化物酶活性[13-14]。導致上述結果可能有兩個原因：一是大腸桿菌血紅素合成量不能滿足需求，導致大部分蛋白以脫輔基形式存在；二是肽鏈不能正確折疊，二硫鍵不能正確形成，導致目標蛋白以包涵體形式存在。

關于增加大腸桿菌菌體內血紅素的累積已有很多報道，根據原理可分為兩種策略。第一種策略通過外加血紅素、提高血紅素轉運能力實現胞內血紅素的累積。1994年Rosenthal研究組在培養基中加入外源血紅素，發現血紅素具有一定的穿透性，但不同的菌種有差異，JM109菌株具有較好的穿透性[15]。2004年，Varnado研究組，將大腸桿菌血紅素轉運基因ChuA和過氧化氫酶基因kat共表達，在外加血紅素的條件下，實現了過氧化氫酶在大腸桿菌中的大規模表達[16]。2008 年，Graves等將類志賀鄰單胞菌Plesiomonas shigelloides中血紅素轉運相關基因hugA、hugB、hugC/D與血紅蛋白基因共表達，在外加血紅素的條件下，全蛋白的表達顯著增加[17]。第二種策略則是通過過量表達血紅素合成途徑中限速酶的基因實現內源血紅素的累積。2006年，何曉梅等將面包酵母 5-氨基酮戊酸合酶 (ALAS) 的基因導入大腸桿菌，促進了大腸桿菌中血紅素的累積，且胞外濃度高于胞內濃度[18]。2006年，王俊卿等將類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides AlAS的基因導入大腸桿菌，導致血紅素前體5-氨基乙酰丙酸 (5-ALA)在大腸桿菌中累積，但其表達受C4合成途徑前體甘氨酸的限制，需要在培養基中外加20 mmol/L的甘氨酸[19]。2010年，Sudhamsu等將亞鐵螯合酶基因 (FC) 和芽胞桿菌一氧化氮合成酶基因(gsNOS) 共表達，在外加25 mg/L 5-ALA條件下，促進了完整的血紅蛋白的形成，從而達到提高含血紅素輔基蛋白酶活力的目的[20]。但這些報道中大多使用了外源的血紅素轉運或合成相關基因，而且需要外加血紅素或者血紅素合成的前體物質 (5-ALA或甘氨酸)。

大腸桿菌血紅素合成采用C5途徑，以谷氨酰tRNA為前體，經過7個中間產物最終形成血紅素。該合成途徑的第一步，即由谷氨酰tRNA合成5-ALA的反應是限速步驟，該步驟由hemA和 hemL基因編碼的谷氨酰 tRNA還原酶(GluTR，HemA) 和谷氨酸半醛變位酶 (GSAM，HemL) 催化[21]。本研究擬過表達大腸桿菌自身的hemA和hemL基因，提高細胞內血紅素含量，并在此基礎上導入小麥過氧化物酶基因WP1，增強WP1在原核系統中的功能性表達。該研究不僅有利于WP1的深入研究與利用，也為其他植物Ⅲ型過氧化物酶超家族成員的活性表達和功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌菌株Turbo、T7 Express為NEB公司產品，OrigamiTMB (DE3) 為Novagen公司產品；克隆載體pMD?19-T 購自TaKaRa公司，雙基因共表達載體pACYCDuet-1為Novagen公司產品；包含小麥過氧化物酶基因WP1的MBP融合表達載體 pET21a-MBP-WP1和 pMAL-p4x-WP1由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶和試劑

PrimeSTAR?HS DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶購自TaKaRa公司；質粒DNA小量試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；限制性內切酶Nco Ⅰ、BamHⅠ、NdeⅠ、XhoⅠ和NotⅠ，Amylose resin、2-Log DNA Ladder、protein marker均為 NEB公司產品；2,2’-聯氮-二 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸) 二銨鹽 (ABTS) 和氨基乙酸丙酸鹽 (5-ALA·HCl) 購自Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 hemA和hemL基因的克隆

利用細菌基因組DNA小量制備法[22]，從大腸桿菌中提取其基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度法檢測 (EVOLUTION 300，Thermo)基因組DNA的完整性和質量。參考GenBank中大腸桿菌 K12基因組序列 (Accession No. NC_010473) 設計用于hemA和hemL基因擴增的特異性引物，具體序列見表1，其中下劃線代表的酶切位點依次為 NcoⅠ、BamHⅠ、NdeⅠ、XhoⅠ，框選部分代表 hemL中的 NdeⅠ突變位點。以大腸桿菌基因組DNA為模板，使用特異引物hemA-f和hemA-r通過PCR擴增獲得hemA；為了將hemL基因中NdeⅠ切點進行同義突變，通過兩步 PCR法獲得 hemL，以 hemL-f和hemL-mr為引物擴增獲得的片段為 hemL1，以hemL-mf和 hemL-r為引物擴增獲得的片段為hemL2；最后以回收的hemL1和 hemL2為模板，hemL-f和 hemL-r為引物擴增獲得全長hemL。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶，純化產物連接到pMD?19-T載體上，將重組質粒轉入大腸桿菌菌株 Turbo感受態細胞中，篩選陽性克隆，重組質粒命名為pMD?19-T-A，pMD?19-T-L，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.2 重組質粒的構建

pMD?19-T-A經NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切獲得的 hemA片段與用相同酶切的 pACYCDuet-1連接，獲得的重組質粒命名為 pACYC-A；pMD?19-T-L經 NdeⅠ和 XhoⅠ雙酶切獲得的hemL片段與用相同酶切的pACYCDuet-1連接，獲得的重組質粒命名為pACYC-L。pACYC-L經NotⅠ和XhoⅠ雙酶切獲得的hemL片段插入經相同酶切的pACYC-A載體，獲得重組質粒命名為pACYC-A-L。

1.2.3 HemA和HemL蛋白在大腸桿菌中的表達

分別將已構建好的3種重組質粒pACYC-A、pACYC-L及pACYC-A-L轉入大腸桿菌T7 Express感受態細胞，將陽性單克隆接種于含抗生素的LB培養基中，37 ℃振蕩培養過夜，按 1∶100的比例接種到50 mL的LB培養基中，培養至對數期 (OD=0.4~0.6)，加入 IPTG (終濃度為0.5 mmol/L)，28 ℃誘導 6 h后，收集菌體。用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 重懸菌體，超聲波破碎細胞，4 ℃，12 000 r/min離心5 min。使用15% SDS-PAGE檢測總蛋白和裂解后的菌液上清。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4 5-ALA含量的測定

參考 Mauzerall的方法[23]測定培養液中5-ALA的含量。對照菌 (T7 Express/pACYCDuet-1)及重組菌 (T7 Express/pACYC-A、T7 Express/ pACYC-L和T7 Express/pACYC-A-L) 28 ℃誘導培養，在6、8、10、12 h分別取2 mL培養液，向離心后的上清中加入0.5 mL乙酰丙酮和1 mL的 2 mol/L的乙酸鈉緩沖液 (pH 4.6)，沸水浴15 min，冷卻至室溫后，加入埃利希氏 (Ehrlich’s)顯色劑[24]，顯色 30 min，用分光光度計檢測554 nm光吸收。以5-ALA·HCl為標準品繪制標準曲線，根據標準曲線計算5-ALA的含量。

1.2.5 卟啉類物質的定性檢測

卟啉類化合物的測定參考臨床化學診斷方法大全一書[25]。取15 mL誘導后菌液上清和5 mL冰乙酸：乙酸乙酯 (HAc-EtAc，1∶4) 于離心管中，劇烈振蕩離心至有機相與水相分離，小心地將有機相吸出，移至另一試管，加入3 mol/L HCl 2.5 mL，劇烈振蕩，卟啉類物質被抽提到下面的鹽酸層。將抽提液進行波長掃描 (350~800 nm)，記錄數據。

1.2.6 融合蛋白的表達與純化

將包含 WP1基因的兩種融合表達載體pMAL-p4x-WP1和 pET21a-MBP-WP1分別與pACYC-A-L共轉入大腸桿菌T7 Express感受態細胞，同時，將兩載體單轉入該菌株，作為對照組。利用含有氨芐青霉素 (50 μg/mL) 和氯霉素(34 μg/mL) 兩種抗生素的LB平板篩選同時包含兩種質粒的陽性菌株，其中 pMAL-p4x-WP1和 pET21a-MBP-WP1為氨芐抗性，pACYC-A-L為氯霉素抗性。蛋白表達具體過程參見1.2.3，收集到的菌體用低鹽緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA (pH 8.0) 重懸，超聲波破碎細胞，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。將離心后的上清液載入Amylose親和層析柱，依次用20倍柱體積低鹽緩沖液，30倍柱體積高鹽緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA (pH 8.0))，20倍柱體積低鹽緩沖液洗柱，最后用洗脫緩沖液 (含 5 g/L麥芽糖的低鹽緩沖液)，獲得MBP-WP1 融合蛋白。然后用 15% SDS-PAGE檢測總蛋白和純化后的蛋白，并通過考馬斯亮藍G-250顯色與標準蛋白曲線比較，計算純化的MBP-WP1濃度。

1.2.7 融合蛋白MBP-WP1的活性檢測

以ABTS為底物，檢測融合蛋白MBP-WP1的過氧化物酶活性[26]：在 25 ℃，將純化到的MBP-WP1加入到1 mL反應體系中，使其終濃度為0.01 g/L，體系包括2.5 mmol/L ABTS、2 mmol/L H2O2、5 mmol/L CaCl2、50 mmol/L pH 5.0的HAc-NaAc。使用紫外可見分光光度儀檢測反應產物在405 nm 的光吸收。

2 結果與分析

2.1 hemA和hemL基因的擴增

以大腸桿菌基因組DNA為模板，使用特異引物hemA-f和hemA-r擴增獲得hemA基因片段，擴增結果見圖1 (泳道1)，與預期大小1 257 bp相當。因后續克隆過程中要使用內切酶NdeⅠ，因而在擴增 hemL基因時，通過兩步PCR法將基因內部的 NdeⅠ切點進行了同義突變(T1152/C1152)。hemL-f和hemL-mr擴增片段hemL1(1 163 bp)、hemL-mf和hemL-r擴增片段hemL2(115 bp) 及兩者重疊延伸獲得的全長 hemL (1 278 bp) 如圖1中3、4和2泳道所示。擴增片段連接到pMD?19-T載體，測序結果顯示克隆的序列與設計完全一致。

圖1 大腸桿菌hemA、hemL 基因的PCR擴增結果Fig. 1 Amplification of hemA and hemL of E. coli by PCR. M: 2-Log DNA ladder; 1: hemA gene; 2: hemL gene; 3: hemL1; 4: hemL2.

2.2 包含hemA和hemL表達載體的構建

將 hemA、hemL分別連入表達載體pACYCDuet-1獲得重組載體 pACYC-A 和pACYC-L；pACYC-L經NotⅠ和XhoⅠ雙酶切獲得hemL片段，將其連入經相同酶切的pACYC-A獲得雙基因重組載體 pACYC-A-L，三者結構如圖2A所示。3種重組載體雙酶切鑒定結果如圖2B所示，pACYC-A和pACYC-L雙酶切后均獲得兩個條帶，一條是與對照 (泳道 1) 一致的空載體，另一條則是與預期一致的目的基因。重組載體pACYC-A-L經NotⅠ、XhoⅠ雙酶切獲得與預期大小一致的5 kb和1.4 kb的兩個條帶。酶切驗證后的載體進一步進行測序驗證，確證無誤后用于后續實驗。

2.3 HemA和HemL在大腸桿菌中的誘導表達

圖2 重組質粒示意圖及載體酶切鑒定結果Fig. 2 Construction and confirmation of recombination vectors. (A) Diagram of recombination vectors. (B) Confirmation of recombination vectors by double digestion. M: 2-Log DNA ladder; 1: pACYCDuet-1 digested with Nco Ⅰ and BamHⅠ; 2: pACYC-A digested with NcoⅠand BamHⅠ; 3: pACYC-L digested with NdeⅠand XhoⅠ; 4: pACYC-A-L digested with NotⅠand XhoⅠ.

圖3 SDS-PAGE分析HemA和HemL在大腸桿菌中的過量表達Fig. 3 Over-expression of HemA and HemL in E. coli analyzed by SDS-PAGE. 1?3: protein of T7 Express/ pACYC-A; 4?6: protein of T7 Express/pACYC-L; 7?9: protein of T7 Express/pACYC-A-L; M: protein marker; 1,4,7: un-induced control; 2,5,8: total protein after inducing; 3,6,9: soluble protein after inducing.

將構建好的重組質粒pACYC-A、pACYC-L和pACYC-A-L，分別轉入大腸桿菌T7 Express感受態細胞，28 ℃誘導后的菌體總蛋白和可溶性蛋白的SDS-PAGE分析結果如圖3所示。從電泳圖中可看出，HemA和HemL均獲得高效過量表達，且目的蛋白均以可溶性形式存在。單獨過量表達HemA或HemL時，目的蛋白的表達量可達菌體總蛋白的50%以上；而同時過量表達HemA和HemL，目的蛋白的表達量則僅占菌體總蛋白的20%左右。這可能是由于兩蛋白同時過表達會導致血紅素合成途徑中間產物的過量累積，而這些物質的累積影響了宿主菌的生長和蛋白合成。另外需要說明的是，hemA和hemL基因長度僅差21 bp，表達的蛋白相差不到 1 kDa，15%的SDS-PAGE不能很好地將它們分離，因此，共表達時只能看到一條重疊的蛋白條帶。

2.4 5-ALA含量的測定

對照菌 (T7 Express/pACYCDuet-1) 及重組菌 (T7 Express/pACYC-A、T7 Express/pACYC-L和T7 Express/pACYC-A-L) 經0.5 mmol/L IPTG誘導不同時間后，分別對它們離心后的培養液中的5-ALA含量進行測定，結果見圖4。由圖知：誘導12 h后，T7 Express/pACYC-A-L培養液中5-ALA含量高達 146.73 mg/L，對照菌中僅為7.27 mg/L, 而 T7 Express/pACYC-A 和T7 Express /pACYC-L培養液中的5-ALA含量分別為：9.67 mg/L、9.54 mg/L。雖然，T7 Express/ pACYC-A和T7 Express/pACYC-L相比于對照菌培養液中的 5-ALA的含量略有增加，但遠遠低于重組菌T7 Express/pACYC-A-L，說明HemA、HemL同時表達要比它們單獨表達更利于大腸桿菌5-ALA的合成，為血紅素合成提供更多的前體。

2.5 卟啉類物質定性檢測

重組菌 T7 Express/pACYC-A-L 通 過0.5 mmol/L IPTG，28 ℃誘導后，菌體和培養液均呈淡粉紅色，而對照菌 T7 Express/ pACYCDuet-1無此現象。Piao等報道[27]，尿卟啉原是無色的，但它氧化產生的卟啉類物質在400~405 nm 處有光吸收，因而可以利用400~405 nm的光吸收判斷培養液中卟啉類化合物的含量。波長掃描結果 (圖 5) 發現重組菌T7 Express/pACYC-A-L的培養液在403 nm處有明顯的光吸收，吸收值達 0.50，重組菌T7 Express/pACYC-A的培養液也有微弱的光吸收，而對照菌T7 Express/pACYCDuet-1和重組菌T7 Express/pACYC-L則沒有明顯的光吸收。此結果與 5-ALA含量的測定結果相吻合，說明 5-ALA含量越高，則卟啉類化合物含量也越高。

圖4 重組菌和對照菌培養液中5-ALA的含量Fig. 4 5-ALA concentration of the culture solution of the recombinant strain and comparative strain.

圖5 重組菌與對照菌培養液提取物光吸收掃描Fig. 5 Wavelength scan of the culture extraction of the recombinant strain and comparative strain.

2.6 融合蛋白的表達與純化

將融合表達載體pMAL-p4x-WP1和pET21a-MBP-WP1分別與重組載體pACYC-A-L共同轉入大腸桿菌 T7 Express感受態細胞進行誘導表達，同時分別將它們單獨轉入此菌株，作為對照。各種重組菌的菌體總蛋白、可溶性蛋白及從中純化獲得的MBP-WP1融合蛋白的SDS-PAGE分析結果如圖6A和6B所示。從圖6A可以看到，融合表達載體 pMAL-p4x-WP1與重組載體pACYC-A-L共轉入 T7 Express后，MBP-WP1部分以可溶性蛋白形式存在，但是表達量比pMAL-p4x-WP1單轉受體菌低；從圖6B可以看出，pET21a-MBP-WP1與pACYC-A-L共轉后，MBP-WP1的表達量同樣低于其單轉受體菌，而且蛋白可溶性下降。共轉化菌株中MBP-WP1表達量的下降可能是其與HemA和HemL競爭菌體內蛋白合成資源所致。

圖6 MBP-WP1融合蛋白表達及純化的SDS-PAGE分析Fig. 6 Expression and purification of fusion protein MBP-WP1 analyzed by SDS-PAGE. (A) Expression of MBP-WP1 in T7 Express/pMAL-p4x-WP1 (5?8) and T7 Express/(pMAL-p4x-WP1+pACYC-A-L) (1?4). M: protein marker; 4,8: un-induced control; 3,7: total protein after inducing; 2,6: soluble protein after inducing; 1,5: purified MBP-WP1. (B) Expression of MBP-WP1 in T7 Express/pET21a-MBP-WP1 (1?4) and T7 Express/ (pET21a-MBP-WP1+pACYC-A-L) (5?8). M: protein marker; 1,5: un-induced control; 2,6: total protein after inducing; 3,7: soluble protein after inducing; 4,8: purified MBP-WP1.

2.7 融合蛋白MBP-WP1的活性檢測

以ABTS為底物測定融合蛋白MBP-WP1的過氧化物酶活性，1 mL的測活體系中MBP-WP1的終濃度為0.01 g/L，從不同菌株中分離純化獲得的融合蛋白的催化能力測定結果如圖7所示。圖中縱坐標為酶促反應速率，用每分鐘內反應液在405 nm吸光度值的變化量表示；橫坐標為利用不同表達體系純化獲得的4種融合蛋白。非分泌型表達載體 pET21a-MBP-WP1單獨轉入大腸桿菌T7 Express獲得的MBP-WP1融合蛋白的過氧化物酶活性與它和重組載體pACYC-A-L共轉后MBP-WP1的活性相比，幾乎沒有變化，而同條件下分泌型表達載體 pMAL-p4x-WP1與重組載體pACYC-A-L共轉后 MBP-WP1的活性是pET21a-MBP-WP1單獨轉化的14.6倍，說明分泌表達和提高內源血紅素含量均可增強重組WP1的活性表達。另外，分泌表達有利于蛋白的正確折疊和二硫鍵的正確形成，如果蛋白不能正確折疊，即便有充足的血紅素，重組WP1的比活力也無明顯變化。

圖7 不同重組菌株MBP-WP1過氧化物酶活力比較Fig. 7 Comparison of the peroxidase activity of MBPWP1 from different recombinant strains. a: T7 Express/ pET21a-MBP-WP1; b: T7 Express/(pET21a-MBPWP1+pACYC-A-L); c: T7 Express/pMAL-p4x-WP1; d: T7 Express/ (pMAL-p4x-WP1+ pACYC-A-L).

3 討論

WP1是典型的植物Ⅲ型分泌型過氧化物酶，這類酶通常以單體形式存在，包含1個血紅素分子和8個保守的半胱氨酸殘基，因而血紅素能否正確結合及二硫鍵能否正確形成是影響該蛋白在大腸桿菌系統中功能性表達的2個核心問題。大腸桿菌hemA和hemL基因分別編碼GluTR和GSAM，它們催化了以谷氨酰tRNA為底物形成5-ALA的反應，該反應是細菌血紅素合成的限速步驟。本研究將單獨包含hemA或hemL基因的重組質粒pACYC-A或pACYC-L，及同時包含兩基因的重組質粒 pACYC-A-L導入宿主菌，SDS-PAGE分析結果顯示三者均出現與預期大小一致的目標蛋白條帶 (圖 3)，由于 HemA和HemL 分子量非常接近，無法判斷導入pACYC-A-L后出現的目標條帶是HemA、HemL或兩者的重疊條帶。但與分別導入hemA或hemL的菌株相比，同時導入hemA和hemL后，去除菌體后的培養液中 5-ALA的含量遠遠高于前兩者 (圖4)，因而可以推斷，導入pACYC-A-L后宿主菌中的hemA和hemL同時實現了過表達，并可將培養基中游離 5-ALA的含量提高到146.73 mg/L。5-ALA累積并不代表血紅素的累積，為了進一步確認卟啉類化合物是否增加，本研究測定了培養液在403 nm的光吸收。與對照菌株、導入pACYC-A或pACYC-L的菌株相比，導入pACYC-A-L后菌落及培養液呈粉紅色，且培養液中卟啉類物質大量累積，該結果與前面測定的不同菌株培養液中 5-ALA的累積量一致。上述結果表明，同時過量表達hemA和hemL可顯著提高大腸桿菌5-ALA、血紅素及其他卟啉類化合物的生物合成。

然而，充足的血紅素并不能保證表達的蛋白一定具有生物學功能，肽鏈的正確折疊、二硫鍵的正確形成同樣非常關鍵。二硫鍵未形成或錯誤形成都會導致這些蛋白積聚形成包涵體，或者導致蛋白結構松散而被降解[28]，而先前利用原核系統表達許多過氧化物酶時目標蛋白通常形成包涵體的現象便是最好的佐證。大腸桿菌胞質是高度還原的介質，不利于二硫鍵的形成和穩定；而外周質中包含促進二硫鍵形成的二硫鍵氧化還原酶 (DsbA，DsbB，DsbC等) 和促進肽鏈正確取向的肽酰脯氨酰順反異構酶 (PPIase)，因而將胞質中不能正確折疊的富半胱氨酸殘基蛋白分泌到外周質，則可獲得部分或全部生物活性[29-31]。本實驗用到了包含 WP1基因的分泌型表達載體 pMAL-p4x-WP1和非分泌型表達載體pET21a-MBP-WP1，由圖7可知，利用分泌型載體獲得的重組WP1的活力約為非分泌型載體的7.5倍。事實上也有商業化可增強細胞質中二硫鍵正確折疊的菌株，如 Novagen公司的OrigamiTM系列菌株和NEB公司的Shuffle?系列菌株，這些菌株均可提高細胞質中二硫鍵的正確折疊。我們也曾將 pMAL-p4x-WP1和 pET21a-MBP-WP1導入OrigamiTMB (DE3) 菌株，但獲得的重組WP1的活力與pMAL-p4x-WP1導入常規的表達菌株T7 Express時相當。由于WP1和其他Ⅲ型植物過氧化物酶均為分泌型蛋白，直接將這類過氧化物酶分泌到外周質比使用商業化菌株更便捷。將pACYC-A-L與pMAL-p4x-WP1共轉后，重組WP1的過氧化物酶活性是單獨轉化pMAL-p4x-WP1的2倍，是單獨轉化pET21a-MBP-WP1的14.6倍，說明通過過表達hemA和hemL增加內源血紅素水平、通過分泌表達促進肽鏈正確折疊和二硫鍵正確形成均可提高 WP1在原核系統中的功能性表達，而且兩種效應可以疊加。將pACYC-A-L與非分泌型載體pET21a-MBP-WP1共轉化宿主菌，獲得的重組WP1的過氧化物酶活性與單獨轉化pET21a-MBP-WP1相比，活力沒有明顯的變化，說明即便有充足的血紅素，如果蛋白不能正確折疊，則血紅素不能正確結合，酶活性也無法提高。上述結果從正反兩方面說明，血紅素和酶蛋白的正確結合是 WP1功能性表達的關鍵。

植物Ⅲ型過氧化物酶家族成員眾多，它們不僅在植物生長發育、逆境響應中發揮重要功能，而且在工業領域具有潛在應用價值，然而利用大腸桿菌表達該類酶時目標蛋白通常以無活性的包涵體形式存在。本研究在不外加血紅素、5-ALA或甘氨酸的條件下，通過過表達hemA和hemL提高胞內血紅素水平、融合MBP增溶、分泌到外周質促進正確折疊等策略，實現了小麥種子過氧化物酶WP1的功能性表達，為WP1進一步的功能研究和開發利用奠定了基礎。該研究為植物Ⅲ型過氧化物酶在大腸桿菌中的表達提供了一個可行的方案，同時也為其他具有重要生物學功能的血紅素輔基蛋白的活性表達提供了有益參考。

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