高通量篩選工具的設計與應用

唐雙焱，梁朝寧，蔣培霞

中國科學院微生物研究所，北京 100101

定向進化是近年發展起來的十分高效的蛋白質改造手段[1]。定向進化方法的內容包括從一個或者多個親本酶出發，經過基因突變和重組人工構建蛋白質突變體文庫，然后通過合適的篩選方法快速從突變體文庫中篩選出符合要求的突變體[2]。鑒于突變的隨機性，定向進化法尤其適用于對僅掌握有限的結構和功能信息的蛋白質進行改造，以獲得某方面特性顯著提高的突變體。即使在已知結構的蛋白質改造上，以定向進化法改造所得到的結果在很多情況下也是人們根據已有的蛋白質結構功能關系的知識所無法預知的。定向進化法彌補了傳統理性設計方法的不足，極大地拓展了蛋白質工程學的研究與應用范圍。在定向進化策略中，突變體文庫的多樣性和高通量篩選方法的建立是成功的關鍵。突變體文庫越大，突變體數量越多，則越有希望篩選到所需要的突變體。對于這些龐大的突變體文庫，高通量的篩選是必需的。目前，構建數量龐大的突變體文庫的方法已日趨成熟，而最大瓶頸是缺乏高通量的篩選方法。很多蛋白質目前還無法用定向進化方法進行改造就是因為缺乏高通量的篩選方法。本文將對現階段一些已經應用或有潛力應用于定向進化中的高通量篩選方法進行綜述。本文將側重于介紹小分子化合物的特異性識別和高通量篩選方法，這些方法通常可用于改造合成這些小分子化合物的酶 (酶對底物的特異性和專一性使之成為最適合合成精細化學分子、手性分子等的催化劑)，或者結合這些小分子化合物的蛋白質如提高抗原抗體親和力等。

1 體內篩選方法

體內篩選方法指根據蛋白質功能與細胞表型之間的關聯關系來進行篩選。體內篩選方法具有成本低、快捷等優勢，但篩選結果也受到諸多因素的影響，如細胞生長情況、蛋白表達量及折疊情況、底物通透性等。

1.1 營養缺陷型菌株篩選法

營養缺陷型菌株是通過誘變處理獲得的，在營養上表現缺陷的菌株，即喪失合成某一物質(如氨基酸、維生素、核苷酸等) 的能力，因而它們在基本培養基上不能生長，必須補充某些物質才能正常生長。營養缺陷型菌株的篩選一般要經過誘變、抗生素淘汰野生型、缺陷型菌株的檢出和鑒定等步驟來獲得。由于營養缺陷型菌株只有在添加了特別成分的培養基中才能生長，因此可以用來對合成這種成分的酶或者合成途徑進行高通量篩選。營養缺陷型菌株已經成功運用在多例酶的定向進化篩選中[3-9]。如Pfleger等在對合成甲羥戊酸的操縱子上3個酶的相對表達量進行改造以提升甲羥戊酸產量的研究中，即用到了營養缺陷型篩選方法[7]。該研究中構建的篩選細胞(大腸桿菌) 依賴甲羥戊酸生長，并同時表達熒光蛋白基因，當甲羥戊酸被合成時，細胞方可在基本培養基上生長，且合成甲羥戊酸的濃度可通過細胞的熒光強度來體現。用該營養缺陷型細胞篩選甲羥戊酸操縱子突變體文庫，成功獲得了高產突變體。Boersma等采用天冬氨酸營養缺陷型細胞篩選法改造來自芽胞桿菌的脂肪酶A[8]。在基本培養基中加入天冬氨酸(S)-(+)-1,2-O-異亞丙基甘油醚作為底物，當底物被脂肪酶A水解產生天冬氨酸時，細胞方能在培養基中生長。通過該方法可篩選到催化活性提高的脂肪酶A。為了篩選到立體選擇性也同步提高的酶突變體，同時在上述培養基中加入了與底物立體結構相反的酶抑制劑膦酸(R)-(-)-1,2-O-異亞丙基甘油醚，并在逐輪的篩選中提高該抑制劑的濃度，最后篩到的酶突變體對(S)-(+)-底物的立體選擇性顯著提高。Kagamiyama等在用定向進化方法改造谷草轉氨酶以增強其合成支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸的催化效率中，成功運用支鏈氨基酸轉氨酶的缺陷型細胞作為篩選工具[9]。谷草轉氨酶催化天冬氨酸的氨基轉移到 α-酮戊二酸形成草酰乙酸和谷氨酸及其逆反應。支鏈氨基酸轉氨酶則催化支鏈氨基酸生物合成最后一步反應，在該酶缺乏的情況下，缺陷型細胞不能在不加支鏈氨基酸的基本培養基上生長。經過篩選，谷草轉氨酶合成纈氨酸和異亮氨酸的效率分別提高了105和7×104倍，而對其天然底物的催化效率下降20倍。

1.2 酵母雙雜交或三雜交篩選法

酵母雙雜交法利用酵母的轉錄調控機制來進行篩選[10-13]。如酵母GAL4轉錄調控蛋白具有兩個功能域：DNA結合功能域和激活功能域。將兩個功能域的編碼基因分別接上不同的蛋白質編碼序列，一個是已知蛋白質序列，另一個是未知的、將進行篩選的蛋白質序列 (突變體文庫)，構建成融合表達載體。當兩個蛋白質能相互作用時，GAL4的DNA結合功能域和激活功能域也相互靠近，重組成有活性的轉錄激活子，開啟受其調控的啟動子表達下游的報告基因，因此通過報告基因的表達可篩選出能和已知蛋白相互作用的蛋白質。酵母雙雜交體系常被用于抗體抗原相互作用等多種突變體文庫的篩選當中[12-13]。

當兩種蛋白質之間的相互作用是由小分子化合物所介導時，酵母雙雜交體系被拓展為酵母三雜交體系，該體系可用于篩選蛋白質與小分子化合物之間的相互作用[14-18]。如 Zhao研究組在改造人的雌激素受體蛋白的配體結合特異性時采用了酵母三雜交方法進行篩選。雌激素受體蛋白的配體結合結構域 (與GAL4 DNA結合功能域形成融合蛋白) 與小分子化合物結合后會發生構象改變，進而與核受體共激活因子 (與GAL4激活功能域形成融合蛋白) 相互作用，從空間上拉近 GAL4兩個功能域進而開啟調控的啟動子表達報告基因。用該方法篩選獲得了分別與藥物類似物4,4￠-二羥基二苯基乙二酮[16]、睪丸酮[17]或皮質酮[18]結合能力顯著提高的雌激素受體蛋白突變體。

酵母三雜交體系還被進一步用來設計小分子化合物的水解酶活性的高通量篩選方法。如頭孢菌素酶可水解頭孢菌素，用化學方法將頭孢菌素同時與氨甲葉酸和地塞米松相連，氨甲葉酸可與二氫葉酸還原酶 (與DNA結合蛋白LexA融合) 結合，地塞米松可與糖皮質激素受體 (與 B42激活功能域融合) 結合，因此氨甲葉酸-頭孢菌素-地塞米松形成化合物橋將 DNA結合蛋白LexA和激活功能域拉近，激活酵母GAL1啟動子表達下游報告基因。當頭孢菌素酶將頭孢菌素水解時，化合物橋被破壞，從而關閉了報告基因的表達，通過該系統可以成功篩選出頭孢菌素酶的活性，亦為篩選其他化合物水解酶或合成酶提供了模式篩選系統[15]。

1.3 轉錄調控因子篩選法

調控蛋白是結合特定的DNA調控序列，通過控制基因開啟和關閉來調節基因轉錄的蛋白。調控蛋白通常與特定小分子化合物結合后發生構象變化，從而改變其與相應DNA調控序列的親和力，激活或者阻遏該啟動子下游基因的轉錄。當酶催化生成的小分子化合物可以誘導特定調控蛋白使之啟動下游報告基因的轉錄和表達時，該調控蛋白可以用作該小分子化合物的信號分子，將該化合物在細胞內的濃度與報告基因的表達強度關聯起來。在對這些小分子化合物的合成酶進行定向進化改造時，這些信號分子將有潛力作為高通量篩選工具，提高化合物的生物合成效率。

然而，自然界缺乏能分別對各種不同小分子化合物產生誘導反應的調控蛋白。因此人們通過對調控蛋白進行改造，使之改變原有的配體結合特異性，轉而受特定的化合物誘導而啟動下游報告基因表達，即定制特定小分子化合物的信號分子[19-21]。通過改造調控蛋白來定制的不同化合物的信號分子將可以用作高通量篩選工具來篩選這些化合物的生物合成途徑突變體以提升其生物合成效率[22]。目前已有多例調控蛋白配體結合特異性成功改造的報道，如受3-羰基己酰基高絲氨酸內酯所誘導的 LuxR調控蛋白被改造成為受不同長度碳鏈的直鏈酰基高絲氨酸內酯所誘導[23]，受四環素誘導的調控蛋白TetR被改造為受四環素類似物 4-去二甲氨基-6-脫氧-6-去甲基四環素所誘導[24]。這些研究證明通過改造調控蛋白定制小分子化合物信號分子這種高通量篩選工具是有效可行的。

1.4 Riboswitch篩選法

細胞中另外一種能將小分子化合物濃度和基因轉錄后調控關聯在一起的分子是Riboswitch[25]。Riboswitch是結合小分子，參與調控基因表達及細胞代謝的RNA分子，它們廣泛分布于細菌中，在真菌和植物中也存在。Riboswitch通常位于mRNA的5￠非翻譯區，也有位于3￠非翻譯區或內含子區域的。其結構包括適配子和表達模塊。當Riboswitch和小分子化合物結合后，RNA構象發生變化，在轉錄、翻譯或者 mRNA水平上開啟或者關閉蛋白質的合成[25-27]。與改造調控蛋白的思路相似，人們也試圖通過改造使Riboswitch與特定的小分子化合物結合而調控基因表達，從而設計小分子化合物的信號分子。如人們用定向進化改造的方法成功獲取了結合 1,3-二甲基黃嘌呤、3-甲基黃嘌呤或硫胺后能高強度激活下游基因表達的Riboswitch[28-29]。這些Riboswitch可將相應小分子化合物在細胞內的濃度用報告基因的表達強度呈現出來，因此也是潛在的高通量篩選工具。

1.5 細胞內熒光標記篩選法

熒光標記是首選的高通量篩選標記，因為它可以用流式細胞分選儀進行篩選。流式細胞分選儀的分選速度可達25 000個細胞/s以上，這使之成為設計高通量篩選方法的首選。用熒光標記底物、產物或者酶的篩選方法用于定向進化研究也日趨增多。

由于缺乏高通量的篩選方法，糖基轉移酶的定向進化改造一直受到限制。在唾液酸轉移酶轉移活性的定向進化改造中，Aharoni等首先設計了連有熒光基團的受體底物，該底物能自由出入大腸桿菌細胞，但當細胞中重組唾液酸轉移酶將唾液酸基團轉移到該受體底物上后，糖基化熒光產物由于其分子大小及電荷原因不能透過細胞膜而滯留在細胞內，因此可以用流式細胞分選法來篩選轉移活性提高了的唾液酸轉移酶突變體[30]。

熒光共振能量轉移近年來也被用在小分子化合物的檢測中[31-32]，該方法既可應用于體內篩選，也可應用于體外篩選。兩個熒光基團，一個基團 (供體) 的發射光譜和另一個基團 (受體)的激發光譜有重疊部分，當它們的空間距離縮小(＜10 nm) 時，供體基團激發的能量被受體基團吸收，使得供體的熒光強度減小而受體的熒光強度增強。Fehr等將大腸桿菌的麥芽糖結合蛋白的N端與 C端分別與橙色熒光蛋白 (供體熒光基團) 和黃色熒光蛋白 (受體熒光基團) 融合，當該融合蛋白結合麥芽糖時，構象變化使得兩個熒光基團靠近，從而發生熒光能量轉移，該融合蛋白被成功用作麥芽糖的信號分子測定麥芽糖的濃度[33]。人們還根據類似原理設計了分別結合葡萄糖[34]、核糖[35]、蔗糖[36]等的信號分子。這些信號分子均有潛力用于高通量篩選這些小分子糖；且該原理亦有潛力應用于設計不同小分子化合物的信號分子。

2 體外篩選方法

盡管體內高通量篩選方法應用廣泛，它們仍然受到細胞生長壓力以及底物跨膜轉運等問題的限制。體外高通量篩選方法則可克服這些方面的限制因素，與體內篩選方法相互補充。體外通量比較高的篩選方法是各種展示技術，即運用DNA重組技術在噬菌體、細菌、真菌等表面展示外源蛋白 (突變體文庫)，篩選蛋白與蛋白或者蛋白與小分子之間相互作用。

2.1 噬菌體展示技術

噬菌體展示技術比較成熟，首先將多肽或蛋白質的編碼基因克隆入噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使之與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的蛋白保持天然的折疊結構，可以被靶分子識別并結合，或者催化底物生成產物。該方法的一大應用是篩選抗體突變體文庫以獲得與抗原結合特異性更高的抗體突變體。首先將抗體突變體文庫展示在噬菌體表面上，將抗原固定在酶標板等固相介質上，加入攜帶了抗體突變體的噬菌體進行結合，然后通過淘洗去除結合特異性差的抗體，最終得到高結合特異性抗體[37-38]。該方法也被應用在酶的定向進化改造中，如Love等用噬菌體展示的篩選方式對大腸桿菌糖基轉移酶進行了定向進化改造。將糖基轉移酶的供體底物和受體底物分別用同位素和生物素進行標記，反應產物用捕捉生物素的膜將標記的受體捕捉到膜上，洗膜后進行放射性計數，放射性強則代表供體底物已被糖基轉移酶有效地轉移到了受體底物上[39]。

2.2 細胞表面展示技術

細胞表面展示技術是通過將靶蛋白 (外源蛋白) 基因序列與特定的載體蛋白基因序列融合后導入細胞，從而使靶蛋白表達并定位在細胞表面的技術。常見的載體蛋白有細菌外膜蛋白、胞外附屬結構 (如鞭毛) 蛋白等，常用的宿主細胞有大腸桿菌和酵母細胞等。細胞表面展示技術也常被用來篩選蛋白與蛋白間的相互作用，特別是抗原抗體間相互作用。盡管由于細胞膜脆性等問題，細胞展示沒有噬菌體展示方法應用廣泛，但其優勢是細菌等細胞大小使其可以采用熒光顯微鏡或者流式細胞分選法來進行篩選。本篩選方法已被成功應用于篩選與抗原高特異性結合的抗體突變體[40]以及酶催化活性的定向進化改造當中[41]。

2.3 核糖體展示技術

核糖體展示技術也是一種篩選功能性蛋白間相互作用的新技術，正確折疊的蛋白質及其mRNA同時結合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質三聚體，該結構使目的蛋白的基因型和表型聯系起來，當目的蛋白能與靶分子高特異性結合時，可以快速獲得其基因型。該技術雖然尚未得到廣泛應用，但也已有一些成功的應用案例[42-44]。

本文著重介紹了用于小分子化合物特異性識別和高通量篩選的方法。小分子化合物產品遍及食品、醫藥、化工等諸多領域，其高通量篩選方法的建立對催化合成小分子化合物的酶的改造研究以及小分子化合物的生物合成途徑研究都具有重要的意義。同時，高通量篩選方法的研究也是定向進化方法學研究的重要組成部分，因此設計和開發新的高通量篩選方法兼具理論和應用價值。

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