微桿菌屬ZZJ4-1菌株的耐熱尿酸氧化酶基因的克隆及重組酶性質

張鵬程，盧向鋒，李倩延，林小清，劉輝，馬曉航

浙江大學生命科學學院，浙江 杭州 310058

尿酸氧化酶 (Urate oxidase，Uox，EC 1.7.3.3)參與嘌呤代謝，催化代謝產物尿酸與氧、水反應生成5-羥基異尿酸。5-羥基異尿酸在溶液中緩慢轉變成尿囊素，在體內迅速被特異性酶催化成尿囊素[1]。Uox廣泛分布于哺乳動物、植物和微生物中[2]。在人類和某些靈長類動物中，由于尿酸氧化酶基因 (uox) 的無義突變使其喪失活性[3]，體內的尿酸不能降解而以代謝終產物的形式被排出，導致尿酸含量偏高。體內過高含量的尿酸容易引發痛風等慢性疾病[3]。此外，腫瘤病人的化療會引發致命的急性高尿酸血癥，如不予控制，將使治療過程難以進行[1]。Uox能在溫和的條件下迅速分解尿酸，因此在臨床上既可用于治療痛風等慢性病，也可用于預防和治療腫瘤溶解綜合征引起的高尿酸血癥[4]。此外，該酶也可用于測定血清[2]、尿液[5]等樣品中的尿酸含量。

目前已知的Uox多數來自微生物，其中包括紅球菌屬 Rhodococcus[6]、擬無枝菌酸菌屬Amycolatopsis[7]、芽胞桿菌屬Bacillus[8]、彎頸霉屬Tolypocladium[9]、假單胞菌屬Pseudomonas[10]、節 桿 菌 屬 Arthrobacter[11]、 假 絲 酵 母 屬Candida[12]、曲霉屬 Aspergillus[13]和微桿菌屬Microbacterium[14]的 菌 株 。 Bacillus 屬 、Arthrobacter屬、Candida屬和Aspergillus屬的某些菌株的uox已在大腸桿菌或酵母菌中克隆并高效重組表達[11-13,15-16]。研究表明不同微生物來源的Uox的理化性質 (如pH、熱穩定性及對金屬離子抑制的敏感性等) 有很大差異[11,17]。不論是應用于臨床治療或是測定，Uox的熱穩定性都非常重要。良好的熱穩定性可保證其作為治療藥物在體內有較長的半衰期，從而減少給藥次數；同時也為尿酸測定試劑的使用、保藏及運輸帶來極大的便利。

實驗室于2005年分離到一株產Uox的微桿菌 ZZJ4-1 菌株 (Microbacterium sp. strain ZZJ4-1)。該菌的Uox有很好的穩定性，在65 ℃時保持穩定，溶液在37 ℃保存數周而不失活[14]，故該酶在臨床治療和測定中有很好的應用前景。本研究克隆該菌的uox，轉化至大腸桿菌中高效表達，并研究了其重組酶的性質。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

野生菌株ZZJ4-1、大腸桿菌Escherichia coli DH5α、BL21 (DE3) 均為實驗室保存。表達載體pET-15b購自Novagen公司。

1.2 酶與試劑

rTaq酶、Pyrobest DNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、T載體克隆試劑盒均購自大連TaKaRa公司。PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自杭州 Axygen公司。DNA Walking SpeedUp試劑盒購自韓國Seegene公司。His·Bind Resin購自德國Merck公司。其余化學試劑均為國產分析純。

1.3 引物合成與測序

表1中引物均由上海Invitrogen公司合成。DNA測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 克隆uox使用的引物Table 1 Primers for uox cloning

1.4 方法

1.4.1 uox基因的克隆

根據 GenBank中已知uox的保守序列設計Primer 1和Primer 2，以菌株ZZJ4-1的基因組為模板進行PCR，擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min ，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經測序得到部分序列后，根據DNA Walking SpeedUp試劑盒說明書分別設計Primer 3、Primer 4、Primer 5與Primer 6、Primer 7、Primer 8，以擴增已知序列的上下游部分。最后拼接測序結果獲得uox的完整序列，并以此設計帶NdeⅠ位點的Primer 9和帶 BamHⅠ位點的 Primer 10，用高保真的Pyrobest DNA聚合酶進行PCR，擴增條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min，進行30個循環；72 ℃延伸7 min。

1.4.2 表達載體的構建和重組Uox的表達純化

分別以NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切高保真PCR的純化產物和pET-15b質粒，連接得到表達載體pET-15b-uox。將表達載體轉化至大腸桿菌E. coli BL21 (DE3) 感受態細胞中。菌落PCR篩選陽性重組子，接種于含100 mg/L氨芐青霉素的TB培養基中，37 ℃培養至OD600約為3.5時，加入IPTG至0.5 mmol/L，22.5 ℃誘導表達18 h。離心收集菌體，用硼酸-硼砂緩沖液 (0.1 mol/L，pH 8.5) 洗1次后重新懸浮，超聲波破壁后離心取上清，即為粗酶液。粗酶液根據His·Bind Resin說明書進行純化。

1.4.3 蛋白濃度測定

蛋白濃度測定用Micro biuret法[18]。

1.4.4 Uox酶活測定

取0.2 mL酶液加至3.8 mL含10 mmol/L尿酸、9 mmol/L4-氨基安替比林和 0.375%苯酚的硼酸-硼砂緩沖液 (0.1 mol/L，pH 8.5) 中，30 ℃水浴10 min后，于540 nm處測定吸光值，以0.2 mL硼酸-硼砂緩沖液 (0.1 mol/L，pH 8.5) 為空白。酶活定義：30 ℃每分鐘分解1 μmol尿酸的酶量為1個單位[14]。

1.4.5 重組Uox分子量測定

將純化的重組Uox進行SDS-PAGE分析，測定其分子量和純度。根據氨基酸序列使用軟件DNASTAR中的Editseq確定分子量。

1.4.6 重組Uox的最佳反應溫度和熱穩定性試驗

在20 ℃~70 ℃的溫度范圍內，每隔5 ℃測定重組酶活性，以確定其最佳反應溫度。將酶置于不同溫度下水浴30 min后測定剩余酶活，以確定其溫度穩定范圍。上述實驗均重復3次。

1.4.7 重組 Uox的最佳反應pH和 pH穩定性試驗

在0.1 mol/L的pH 3.0~11.0的緩沖體系中測定重組酶活性 (pH 3.0~5.5為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 6.0~8.0為磷酸鹽緩沖液；pH 8.0~9.0為硼砂-硼酸緩沖液；pH 9.5~11.0為硼砂-NaOH緩沖液)，以確定其最佳反應pH。在上述不同的緩沖體系中加入酶液，于 25 ℃保溫 18 h，取0.2 mL加至酶活測試體系中測定剩余酶活，以確定酶的pH穩定范圍。上述實驗均重復3次。

1.4.8 酶促反應動力學

以Lineweaver-Burk作圖法[19]，測定重組Uox對尿酸的Km值。根據其比活和分子量確定Kcat。

1.4.9 不同化學物質對重組Uox的影響

在酶液中加入不同的化學物質溶液后25 ℃水浴30 min，取0.2 mL酶液加至酶活測試體系中測定剩余酶活。

2 結果與分析

2.1 uox的克隆結果與序列分析

以Primer 1和Primer 2為引物的PCR產物約600 bp，經DNA Walking SpeedUp試劑盒擴增上下游序列分別得到約500 bp和450 bp的產物，拼接后表明uox開放閱讀框為894 bp，編碼297個氨基酸。該基因的 GenBank登錄號為JQ066818。通過NCBI的blastn和blastp將其分別與已報道的uox和Uox進行比對。其中該uox序列與球形節桿菌 Arthrobacter globiformis[11]同源性最高 (72%)，而與產朊假絲酵母 Candida utilis[12,20]、黃曲霉Aspergillus flavus[13]、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis[15]、芽胞桿菌TB-90菌株Bacillus sp. TB-90[17]均無明顯同源性；Uox序列比對表明同源性分別為64%、34%、35%、24%和26%。使用OMIGA 2.0進行氨基酸多序列比對，結果見圖1。

使用 SWISS-MODEL[21]預測該酶的空間結構，推測其為同源四聚體 (圖2)，尿酸結合位點由58位的蘇氨酸、59位的天冬氨酸和相鄰亞基上158位的苯丙氨酸、175位的精氨酸、217位的亮氨酸、218位的谷氨酰胺構成。

2.2 表達載體pET-15b-uox的構建與鑒定

以 Primer 9和 Primer 10為引物的高保真PCR得到約900 bp的產物，與質粒pET-15b分別以NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接，轉化至大腸桿菌E. coli BL21 (DE3) 感受態細胞中。雙酶切陽性重組子的質粒后電泳，得到分別約為900 bp和5.7 kb的兩條條帶，與uox和空白載體大小相符，證明篩選成功 (圖3)。

2.3 重組Uox的主要性質

2.3.1 重組Uox的分子量

重組Uox經純化后在SDS-PAGE中顯示為單一條帶，表明它由一種大小約為35 kDa的亞基組成 (圖4)。軟件DNASTAR中Editseq計算其大小為35 857.55 Da，與電泳結果相符。

圖1 不同微生物Uox的多序列比對Fig. 1 A multiple alignment of Uox from different microorganisms. Uox from strain ZZJ4-1 was aligned with those from A. globiformis[11], A. flavus[13], C. utilis[12] and Bacillus sp. TB-90[17]. The light grey areas indicate low conserved sequences, the dark grey areas indicate high conserved sequences. The asterisks indicate the putative uric acid binding site of Uox from stain ZZJ4-1.

2.3.2 重組Uox的最佳反應溫度與熱穩定性

在不同的溫度下測定酶活性，結果見圖5，酶的最佳反應溫度為30 ℃。在不同的溫度下水浴30 min后測定剩余酶活，結果見圖6，該酶在65 ℃處理后仍保留92.2%的酶活。

2.3.3 重組Uox的最佳反應pH與pH穩定性

在不同pH的緩沖液中測定酶活性，結果見圖7，重組Uox的最佳反應pH為7.5，緩沖液為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液。酶液在不同pH的緩沖液中25 ℃水浴18 h后測定剩余酶活，結果見圖8，該酶在pH 8.5~11.0的緩沖液中有較好的穩定性。

2.3.4 酶促反應動力學

以Lineweaver-Burk作圖法求得重組Uox以尿酸為底物的Km為0.22 mmol/L。根據比活和分子量計算其Kcat為2.2/s。

圖2 預測的Uox同源四聚體結構Fig. 2 Predicted tetramer structure of Uox.

圖3 表達載體pET-15b-uox的雙酶切鑒定Fig. 3 Identification of expression vector pET-15b-uox by enzyme digestion. M: marker; A: pET-15b-uox; B: pET-15b-uox digested with NdeⅠand BamHⅠ.

圖4 重組Uox的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of recombinant Uox. M: marker; A: purified recombinant Uox.

圖5 不同溫度下重組Uox的活性Fig. 5 Effects of temperature on recombinant Uox activity.

圖6 重組Uox的熱穩定性Fig. 6 Thermal stability of recombinant Uox.

圖7 不同pH下重組Uox的活性Fig. 7 Effects of pH on recombinant Uox activity. pH 3.0?6.0: 0.1 mol/L citrate buffer; pH 6.0?8.5: 0.1 mol/L phosphate buffer; pH 8.5?9.5: 0.1 mol/L borate buffer; pH 9.5?11.0: 0.1 mol/L borax-NaOH buffer.

圖8 重組Uox的pH穩定性Fig. 8 pH stability of recombinant Uox. pH 3.0?6.0: 0.1 mol/L citrate buffer; pH 6.0?8.0: 0.1 mol/L phosphate buffer; pH 8.0?9.0: 0.1 mol/L borate buffer; pH 9.5?11.0: 0.1 mol/L borax-NaOH buffer.

2.3.5 不同化學物質對酶活的影響

由圖9可知，濃度均為1 mmol/L的Ag+、Zn2+、Cu2+使重組Uox幾乎完全失活，而Mn2+、Li+、Ba2+、Mg2+、Ca2+和Fe3+對酶活沒有顯著影響。表2顯示表面活性劑Tween 20、Tween 80和 Triton X-100對酶活有一定的促進作用，而SDS可使酶幾乎完全失活；NaN3和金屬螯合物1,10-菲羅啉、EDTA能輕微抑制酶活。

2.4 重組Uox和原酶的性質比較

比較重組Uox和Zhou[22]報道的原酶性質，結果見表3、4。除了最佳溫度相同外，兩者其他性質均有差異。重組酶熱穩定性略優于原酶，最佳反應pH 7.5小于原酶的8.5，pH穩定范圍則從原酶的7.0~10.0變為8.5~11.0，Km和Kcat均小于原酶。兩者受Cu2+、Zn2+和1,10-菲羅啉影響差異較大。

圖9 不同金屬離子對重組Uox的影響Fig. 9 Effects of metal ions on recombinant Uox.

表2 不同化學物質對重組Uox的影響Table 2 Effects of chemicals on recombinant Uox

表3 原酶和重組Uox的性質比較Table 3 Properties of native Uox and recombinant Uox

表4 原酶和重組Uox受化學物質影響的差異Table 4 Effects of different chemicals on native Uox and recombinant Uox

3 討論

預測的菌株ZZJ4-1的Uox的尿酸結合位點與A. globiformis[11]的Uox的位點一致，并與其他微生物來源的Uox的位點有較高的同源性[12-13,17,20](圖1)。菌株ZZJ4-1、A. globiformis[11]、A. flavus[13]和C. utilis[12,20]的Uox在區域A和區域B高度同源，而與Bacillus sp. TB-90[17]的Uox有較大差異 (圖1)。Koyama等[12]敲除區域A后發現喪失酶活，推測其對酶的活性是必需的；區域 B與真核生物的二型銅離子結合位點H-X-H-X-F 相 同 。 Suzuki等[11]報 道 的A. globiformis的Uox含銅離子，但序列中存在該結合位點的A. flavus[1]的Uox中卻不含銅離子，而Yamamoto等[17]報道的 Bacillus sp. TB-90的Uox不含該結合位點，也不與銅離子結合。菌株ZZJ4-1的Uox含有該結合位點H-D-H-S-F，且被1,10-菲羅啉強烈抑制，推測該酶含銅離子。

該酶在大腸桿菌中重組表達后，菌液的酶活可達 36.7 U/mL，比菌株 ZZJ4-1菌液的酶活1.0 U/mL提高了35倍[14]。重組酶比原酶熱穩定性好，這一現象也出現在Yamamoto等[17]和Zhu等[20]的重組表達研究中，可能是重組酶比原酶多十幾個氨基酸保護結構，使其不易熱變性。與Zhu等[20]報道的重組酶相同，本研究的重組酶最適pH也變小，這可能是組氨酸標簽的影響。根據 1,10-菲羅啉對原酶和重組酶影響的差異，推測重組酶比原酶更緊密地結合金屬離子，使其免受絡合物的影響。

不同來源的 Uox對各種金屬離子的反應有很大的差異。Suzuki等[11]比較了來自Arthrobacter屬、Bacillus屬和Candida屬的Uox受不同金屬離子的影響情況。其中 Arthrobacter屬和Candida屬的Uox與本研究的酶相似，幾乎被銅離子完全抑制，而Bacillus屬的仍保留40%的酶活；Arthrobacter屬的Uox和本研究的酶均能被鋅離子完全抑制，Candida屬的剩余64%酶活，而Bacillus屬的完全不受其影響；受銀離子抑制最明顯的是 Candida屬的 Uox和本研究的酶，Bacillus屬的受輕微抑制，而 Arthrobacter屬的不受影響；鐵離子幾乎完全抑制Bacillus屬和Candida屬的Uox，但幾乎不影響Arthrobacter屬的和本研究的酶。

本研究的重組酶在65 ℃處理30 min后仍保留 92.2%的活性，70 ℃處理后保留 77.9%，其耐熱性優于其他微生物來源的 Uox的重組酶[11-12,15,17,20]，是目前已知序列的Uox中熱穩定性最佳的。Lotfy等[23]在Bacillus thermocatenulatus中發現的Uox在75 ℃處理45 min后仍保留100%的活性，在80 ℃處理45 min后保留70%的活性，比菌株ZZJ4-1的Uox熱穩定性更好，但迄今為止未報道其基因和蛋白的研究結果，故該酶的詳細情況未知。

鑒于該重組酶高效的表達和良好的熱穩定性，相信其在臨床治療和測定中會有良好的應用前景。

REFERENCES

[1] Gabison L, Prangé T, Colloc'h N, et al. Structural analysis of urate oxidase in complex with its natural substrate inhibited by cyanide: mechanistic implications. BMC Struct Biol, 2008, 8(1): 32?39.

[2] Huang SH, Shih YC, Wu CY, et al. Detection of serum uric acid using the optical polymeric enzyme biochip system. Biosens Bioelectron, 2004, 19(12): 1627?1633.

[3] Wu XW, Lee CC, Muzny DM, et al. Urate oxidase: primary structure and evolutionary implications. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(23): 9412?9416.

[4] Cammalleri L, Malaguarnera M. Rasburicase represents a new tool for hyperuricemia in tumor lysis syndrome and in gout. Int J Med Sci, 2007, 4(2): 83?93.

[5] Zhang FF, Wang XL, Ai SY, et al. Immobilization of uricase on ZnO nanorods for a reagentless uric acid biosensor. Anal Chim Acta, 2004, 519(2): 155?160.

[6] Mcleod MP, Warren RL, Hsiao WWL, et al. The complete genome of Rhodococcus sp. RHA1 provides insights into a catabolic powerhouse. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(42): 15582?15587.

[7] Zhao W, Zhong Y, Yuan H, et al. Complete genome sequence of the rifamycin SV-producing Amycolatopsis mediterranei U32 revealed its genetic characteristics in phylogeny and metabolism. Cell Res, 2010, 20(10): 1096?1108.

[8] Deng Y, Zhu YG, Wang PX, et al. Complete genome sequence of Bacillus subtilis BSn5, an endophytic bacterium of Amorphophallus konjac with antimicrobial activity for the plant pathogen Erwinia carotovora subsp. carotovora. J Bacteriol, 2011, 193(8): 2070?2071.

[9] Hongoh Y, Ishikawa H. Evolutionary studies on uricases of fungal endosymbionts of aphids and planthoppers. J Mol Evol, 2000, 51(3): 265?277.

[10] Abdel-Fattah YR, Saeed HM, Gohar YM, et al. Improved production of Pseudomonas aeruginosa uricase by optimization of process parameters through statistical experimental designs. Process Biochem, 2005, 40(5): 1707?1714.

[11] Suzuki K, Sakasegawa SI, Misaki H, et al. Molecular cloning and expression of uricase gene from Arthrobacter globiformis in Escherichia coli and characterization of the gene product. J Biosci Bioeng, 2004, 98(3): 153?158.

[12] Koyama Y, Ichikawa T, Nakano E. Cloning, sequence analysis, and expression in Escherichia coli of the gene encoding the Candida utilis urate oxidase (uricase). J Biochem, 1996, 120(5): 969?973.

[13] Legoux R, Delpech B, Dumont X, et al. Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding Aspergillus flavus urate oxidase. J Biol Chem, 1992, 267(12): 8565?8570.

[14] Zhou XL, Ma XH, Sun GQ, et al. Isolation of a thermostable uricase-producing bacterium and study on its enzyme production conditions. Process Biochem, 2005, 40(12): 3749?3753.

[15] Pfrimer P, de Maria LMP, Galdino AS, et al. Cloning, purification, and partial characterization of Bacillus subtilis urate oxidase expressed in Escherichia coli. J Biomed Biotechnol, 2010: 674908.

[16] Chen ZY, Wang ZY, He XP, et al. Uricase production by a recombinant Hansenula polymorpha strain harboring Candida utilis uricase gene. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 79(4): 545?554.

[17] Yamamoto K, Kojima Y, Kikuchi T, et al. Nucleotide sequence of the uricase gene from Bacillus sp. TB-90. J Biochem, 1996, 119(1): 80?84.

[18] Goa J. A micro biuret method for protein determination of total protein in cerebrospinal fluid. Scand J Clin Lab Invest, 1953, 5(3): 218?222.

[19] Lineweaver H, Burk D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am Chem Soc, 1934, 56(3): 658?666.

[20] Zhu XJ, Liu JG, Li GX. Cloning and expression of urate oxidase and its application in serum uric acid analysis. Chin J Biotech, 2001, 17(1): 68?72.朱獻軍, 劉建國, 黎高翔. 尿酸氧化酶基因的克隆、表達及其產物的應用. 生物工程學報, 2001, 17(1): 68?72.

[21] Schwede T, Kopp J, Guex N, et al. Swiss-model: an automated protein homology-modeling server. Nucl Acids Res, 2003, 31(13): 3381?3385.

[22] Zhou XL. Isolation of a uricase-producing bacterium and study on the characteristics of the uricase [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2005.周學來. 一株產尿酸氧化酶菌株的分離及酶特性研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2005.

[23] Lotfy WA. Production of a thermostable uricase by a novel Bacillus thermocatenulatus strain. Bioresour Technol, 2008, 99(4): 699?702.