利用核糖體工程選育丙酮丁醇菌提高丁醇產量

陳麗杰，商光來，袁文杰，吳又多，白鳳武

大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024

丁醇作為一種新型的生物燃料，具有其獨特的性質：能量密度高、腐蝕性低、揮發性低[1]，與汽油的性質相似，可直接用于現有的發動機系統，已受到世界各國的廣泛關注。目前丁醇發酵中，丁醇的產量相對較低，這加大了后續分離成本，降低了其經濟實用性，因此提高丁醇產量是提高丁醇產業經濟性的手段之一[2]。微生物發酵產業中，微生物菌種起著至關重要的作用。性狀優良的高產菌株可以減少發酵和產物分離成本，提高經濟效益，具有良好的科學研究價值和市場潛力[3]，因此獲得一株高產丁醇菌株成為提高丁醇產量的前提。丁醇本身對發酵菌株C. acetobutylicum 具有很大的毒性。當丁醇濃度達到10~11 g/L時，菌體生長受到強烈抑制，并大量死亡[4]，從而限制更高濃度丁醇的生成，因此菌體對丁醇的耐受性低也是制約丁醇產量提高的重要因素[5]。

核糖體是微生物進行蛋白質合成的重要細胞器，與胞內代謝活動、基本生理過程密切相關。核糖體發生突變將嚴重影響胞內物質的代謝[6]。核糖體工程技術是近幾年發展起來的微生物育種方法。通過向微生物核糖體組分 (核糖體蛋白和 rRNA) 引入點突變，調控代謝系統，誘導或刺激代謝產物的表達，獲得代謝產物合成能力提高的突變菌株[7-8]。通常使用鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素誘變微生物，使其核糖體發生突變。核糖體工程技術具有較好的誘變效果，目前主要用于提高微生物代謝物的產量及化學耐受程度等[6,9-10]。Kurosawa等[11]以枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis 168為出發菌誘變獲得鏈霉素突變株，其α-amylase和protease產量提高了 20%~30%。Hosokawa等[12]對惡臭假單胞菌Pseudomonas putida KH146-2進行鏈霉素、利福平和慶大霉素的抗性誘變，篩選得到的抗生素突變株對 4-羥基苯甲酸丁酯耐受程度由出發菌的0.8%提高到5%。

與其他的育種方法相比，核糖體工程簡單易行，無需特殊設備，便于大批量的篩選。在所使用的抗生素中，鏈霉素誘變效果較好，正突變和增產率高，且其抗性突變在誘變育種中應用較多[10]。核糖體工程用于C. acetobutylicum的誘變篩選，以提高丁醇產量目前還沒有報道。鑒于此，本文通過核糖體工程技術，使用鏈霉素誘變C. acetobutylicum L7，期望獲得高產高耐丁醇菌株，解決丁醇產量低的實際問題，并為后續的研究工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

本實驗室馴化保存的丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum L7。

1.1.2 培養基

活化培養基 (g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨30，酵母粉10。

發酵培養基 (g/L)：葡萄糖70，CH3COONH42.3，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO4·3H2O 0.5，KH2PO40.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，酵母粉2，生物素0.01，對氨基苯甲酸0.01，pH 5.5。

平板培養基 (g/L)：葡萄糖30，CH3COONH42.3，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO4·3H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，胰蛋白胨6，瓊脂20，pH 6.2。

抗生素：配制濃度為20 g/L的鏈霉素母液，保存于?20 ℃。使用時按一定比例稀釋。

所用培養基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

菌種活化：將1 mL冷凍保藏的菌種接種于20 mL活化培養基中，37.5 ℃厭氧箱 (Forma 1029，Thermo Fisher Scientific) 中活化培養。

搖瓶培養：將活化好的菌種以10% (V/V)的接種量接種于110 mL發酵培養基中，37.5 ℃厭氧箱中靜置培養。

發酵培養：1.2 L發酵培養基裝入3 L發酵罐(1.5BG-4-3000，上海保興生物公司) 中，通氮氣30 min，保證罐內厭氧環境。將菌種以10% (V/V)的接種量接于發酵罐內，發酵溫度37.5 ℃，轉速150 r/min。

1.2.2 菌體濃度的測定

在620 nm測量菌體的吸光度作為菌體的濃度 (OD620)，空白對照為離心后的發酵液。

1.2.3 鏈霉素最小抑菌濃度的確定

將處于對數生長期的菌液 (OD620≈1.0) 涂布于含有不同濃度 (0、2、4··10··50) mg/L的鏈霉素平板上，每個平板100 μL，相同鏈霉素濃度設置3個平行，37.5 ℃厭氧箱中培養2 d，觀察菌落的生長情況，記錄無菌落生長的最小鏈霉素濃度，即為鏈霉素對C. acetobutylicum L7的最小抑菌濃度[13]。

1.2.4 核糖體工程誘變篩選 C. acetobutylicum L7技術路線

使用鏈霉素對C. acetobutylicum L7進行核糖體工程誘變育種。將活化好的菌液涂布于含有4~5倍MIC的鏈霉素平板上，培養4~5 d。挑取直徑較大或形態與原始菌有差異的菌落，96深孔板活化培養20 h，以10% (V/V)的接種量接于發酵培養基中培養72 h，氣相色譜檢測丁醇產量，比較得出產量提高較多的菌株 (以原始菌為對照)。再以其為出發菌，涂布獲得單菌落，將其挑至鏈霉素平板上，此時濃度比前次篩選菌株時增加5 mg/L，挑取菌落進行發酵檢測，重復以上步驟直到獲得高產菌株。經過長時間大批量的誘變篩選，最終獲得丁醇產量提高率在10%左右的菌株。以上操作均在37.5 ℃厭氧箱中進行。誘變篩選技術路線如圖1所示。

1.2.5 氧化還原電位 (ORP) 和pH值的測定

分別采用氧化還原電極 (Pt4805-DPAS-SCK8S, Mettler Toledo) 和 pH電極 (405-60-T-S7/ 120/9848，Mettler Toledo) 測定。

1.2.6 糖濃度的測定

葡萄糖濃度使用SBA-40E生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所) 測定。發酵液離心，取上清稀釋至糖濃度小于1 g/L，取25 μL稀釋液直接進樣，讀取數值，并計算發酵液的糖濃度。

圖1 核糖體工程篩選丁醇高產菌路線圖Fig. 1 Schematic diagram of screening for high butanol-yield strain by ribosome engineering.

1.2.7 溶劑及有機酸的測定

Agilent6890氣相色譜測定發酵液中各溶劑的含量。檢測條件：毛細管色譜柱 (30 m×0.25 mm× 0.50 μm)，柱溫120 ℃；進樣口溫度250 ℃；FID檢測器溫度300 ℃。H2流速40 mL/min；空氣流速 400 mL/min；N2流速 30 mL/min，進樣量0.2 μL。采用內標法測量，內標物為異丁醇。

Waters1525液相色譜測定有機酸濃度。檢測條件：Aminex HPX-87H 有機酸分析柱(300 mm×7.8 mm)，柱溫 50 ℃，二極管陣列檢測波長210 nm，示差折光檢測器溫度50 ℃。流動相及流速：0.005 mol/L H2SO4，0.5 mL/min，進樣量：20 μL。

1.2.8 發酵液粘度測定方法

采用NDJ-1旋轉式粘度計 (上海方瑞儀器有限公司) 測定。選擇合適轉子，將其浸沒在待測發酵液中，室溫下調整到合適的轉速對發酵液粘度進行測定。

1.2.9 丁醇耐性實驗

將活化好的菌種以 5% (V/V)的接種量接種于500 mL活化培養基中，37.5 ℃厭氧箱中培養。待菌體生長到OD620≈1.0時，充分混勻，分裝于4個搖瓶中，每瓶100 mL，添加丁醇至濃度為0、 6、12、14 g/L。測定不同丁醇濃度下菌體的生長情況，以OD620表示。

2 結果與分析

2.1 鏈霉素對C. acetobutylicum L7的最小抑菌濃度

微生物具有一定的抗生素耐受濃度，高抗生素濃度下微生物全部被殺死，而低濃度下則發生突變的概率極低，不易獲得突變菌株[14]，因此確定抗生素篩選濃度非常重要。合適的抗生素濃度將有利于誘變工作的進行，提高誘變效率。最小抑菌濃度 MIC是反應抗菌活性和能力的一個指標，定義抗生素的 MIC為無菌落生長的最小抗生素濃度。

按照 1.2.3方法進行平板涂布，并記錄不同鏈霉素濃度下C. acetobutylicum L7菌落生長情況，如圖2所示。從圖中可以看出，無鏈霉素的平板中，C. acetobutylicum L7生長好，培養至2 d時菌體鋪滿整個平板，無單菌落 (圖A)；在含有鏈霉素的平板上，菌體生長受到抑制。10 mg/L鏈霉素濃度下，C. acetobutylicum L7在2 d內無菌落生長 (圖B)，確定10 mg/L為MIC；在40~50 mg/L的鏈霉素平板中，大部分菌體被殺死，培養至4 d只有2~4個菌落存活，形態如圖C和圖D。生長出的菌落為鏈霉素抗性菌，有可能發生突變。

在確定鏈霉素的MIC后，按照1.2.4設計的技術路線，通過平板轉接逐次提高鏈霉素濃度開始誘變篩選C. acetobutylicum L7，以獲得丁醇高產菌株。

2.2 丁醇高產菌S3的獲得及傳代穩定性

得到丁醇高產的 C. acetobutylicum一直是人們關注的焦點。通過使用鏈霉素的核糖體工程育種技術大批量篩選，共獲得 6株丁醇產量較高的菌株，其中7倍MIC鏈霉素抗性菌株S3丁醇產量最高，達到(12.00±0.10) g/L，如表 1所示。

通過分析表中篩選結果，得出鏈霉素用于誘變C. acetobutylicum提高丁醇產量，效果比較理想?？剐跃校琒13丁醇產量最低，為(11.72±0.11) g/L，提高了10.05%；其他5株菌丁醇產量提高率在10.14%~12.68%。

連續傳代次數用于表達微生物菌株的使用壽命。傳代穩定說明菌株性狀優良，不易衰退[15]。通過核糖體工程技術篩選所獲得的6株菌，對其進行傳代發酵實驗，發現S3的發酵性能最穩定，結果見表2。從表中可以看出，傳代5次，S3的丁醇和總溶劑產量較穩定，分別維持在11.8 g/L和18.7 g/L左右，相比于原始菌一直穩定高產；丁醇在總溶劑中所占比例為0.62~0.63。說明S3遺傳穩定性較好，有利于后續研究的進行。

2.3 S3與C. acetobutylicum L7的生長及發酵特性

為考察S3生長及發酵情況，將S3進行上罐發酵實驗，并與原始菌進行了對比。兩者的生長、耗糖、各溶劑、有機酸的生成及 ORP變化情況如圖3~5所示。

圖2 鏈霉素平板中C. acetobutylicum L7的生長情況Fig. 2 The growth of C. acetobutylicum L7 on streptomycin plates with different concentrations. (A) 0 mg/L streptomycin. (B) 10 mg/L streptomycin. (C) 40 mg/L streptomycin. (D) 50 mg/L streptomycin.

表1 核糖體工程用于C. acetobutylicum L7的篩選結果Table 1 The high butanol-producing Clostridium strains by ribosome engineering

表2 S3傳代穩定性Table 2 The genetic stability of S3

圖3 原始菌 (A) 和S3 (B) 的OD620、pH及殘糖曲線Fig. 3 Time course of OD620, pH and residual sugars by C. acetobutylicum L7 (A) and S3 strain (B).

圖4 原始菌 (A) 和S3 (B) 的發酵生產溶劑及有機酸曲線Fig. 4 Time course of solvents and acids production by C. acetobutylicum L7 (A) and S3 strain (B).

圖5 原始菌和S3的ORP曲線Fig. 5 Time course of ORP by C. acetobutylicum L7 and S3 strain. ORP: oxidoreduction potential.

丁醇發酵分為兩個時期：產酸期，菌體快速生長，產生有機酸 (乙酸和丁酸)，pH降低；產溶劑期，菌體代謝相對緩慢，溶劑 (丙酮、丁醇和乙醇) 大量生成，并伴隨乙酸和丁酸的重吸收，pH緩慢升高。發酵過程中，菌體為維持自身代謝，消耗大量的葡萄糖。如圖3和圖4所示，S3和原始菌在產酸期代謝旺盛，生物量 OD620快速增加；14 h左右，二者pH降到最低，即pH拐點，此時S3的pH值 (4.3) 和原始菌的 (4.2)相當，發酵液中積累乙酸的量分別為2.01 g/L、2.05 g/L；丁酸2.06 g/L、2.13 g/L，為發酵過程中酸積累的最大濃度。之后有機酸毒性顯現，C. acetobutylicum開始酸的重吸收，酸濃度降低，溶劑快速生成，pH升高。隨著發酵進行，S3和原始菌OD620達到最大，分別為3.18、3.19，此時51.4%的葡萄糖已被消耗。之后10 h, 溶劑繼續生成，丁醇毒性開始發揮作用，菌體OD620下降；此階段 S3和原始菌分別產生 3.78 g/L、2.26 g/L的丁醇，S3優勢比較明顯。隨著丁醇濃度的增加，毒性進一步加大，加上營養匱乏，菌體代謝停止，發酵結束，各溶劑產量達到最大。

微生物代謝過程中會產生和消耗氧化還原力：NAD(P) 與 NAD(P)H，且胞內 NAD(P)/ NAD(P)H水平與菌體代謝和溶劑產生緊密相關[16-18]。氧化還原電位 (ORP) 是發酵體系氧化-還原性的外在反映[19]。分析原始菌和S3的發酵過程，發現 ORP變化與菌體生長、有機酸產生和重吸收、溶劑生成、pH變化密切偶聯。如圖3~5所示，菌體生長代謝產生大量有機酸，pH快速下降；同時產生大量能量和NAD(P)H，ORP隨之降低。當有機酸積累到一定程度，毒性顯現，其分子態形式可以透過細胞膜，自由進入菌體產生解偶聯毒害作用[20-21]。于是開啟酸的重吸收通路，溶劑大量生成，有機酸濃度下降，pH緩慢升高，ORP趨向穩定。隨丁醇濃度的增加，細胞代謝受到抑制，菌體加速死亡，ORP升高至發酵結束。ORP在發酵全程伴隨菌體生理代謝發生響應變化[16]。發酵前24 h，S3的ORP表觀響應更為迅速，在?493 mV至?470 mV之間變化，浮動較大；隨后的15 h內，其維持在?490 mV左右，相比原始菌，此階段還原力依然較強，產生5.52 g/L丁醇，而原始菌只生成 3.15 g/L，說明在產溶劑期為主的生理代謝階段，S3迅速積累溶劑丁醇，并具有更高的代謝通量，與 ORP的階段性穩定 (?490 mV狀態下) 存在一定的關聯性。針對C. acetobutylicum進行ORP調控以提高菌體發酵性能的研究已有報道[22]，全程控制ORP有利于菌體提前進入溶劑期，溶劑產量提高，發酵時間縮短，且 ORP的有效調控將改變細胞的代謝流及生理過程。本研究通過核糖體工程選育的菌株S3，其發酵過程ORP變化與丁醇代謝通量亦存在明顯關聯，暗示若ORP控制在?490 mV，菌體丁醇代謝通量極有可能進一步提高。

對S3與C. acetobutylicum L7發酵終點時，消耗糖濃、各溶劑產量及丁醇/糖等參數進行了比較 (表3)。

表3 S3與原始菌的比較Table 3 The comparison of S3 with C. acetobutylicum L7

C. acetobutylicum發酵產生3種溶劑：丙酮(A)、丁醇 (B) 和乙醇 (E)。發酵終點，A、B、E三者比例一般在3∶6∶1左右。表3數據顯示，S3和原始菌的 A/B/E比例相差不大；生長過程中消耗的葡萄糖和最大生物量OD620基本相同，而最終S3生成的丁醇和乙醇比原始菌高，分別提高11.2% (1.26 g/L)、50% (0.57 g/L)，丙酮相差很小，總溶劑相應提高9.7% (1.79 g/L)；丁醇/糖轉化率由原始菌的0.19提高到0.22。S3發酵結束用時52 h，相比原始菌少9 h，發酵周期縮短，而產生的丁醇較多，說明S3丁醇的生產效率較高，達到 0.24 g/(L·h)，相比提高 30.5%；因此S3在發酵中將更有優勢，可以產生較多的溶劑，其經濟可行性得到提高。整個丁醇發酵過程中，有機酸的重吸收與溶劑產生相偶聯。S3與原始菌有機酸的重吸收量分別為2.70 g/L、2.89 g/L，相差不大；二者丙酮產量基本相同，而S3的丁醇與乙醇總產量相比原始菌高1.83 g/L，可以推測S3的丁醇與乙醇代謝通量有可能發生了變化。生成丁醇與乙醇的途徑中，丁醇脫氫酶和乙醇脫氫酶是兩個關鍵酶，且相互關聯；二者結構是否發生改變或活性增強，是否為核糖體工程作用的靶點，有待于下一步進行研究確定。

丁醇發酵后期，發酵液里存有大量菌體和一些其他物質，例如金屬離子、無機鹽、菌體自溶產生的蛋白、多糖、核酸等，致使發酵液具有一定的粘性，影響了整個發酵體系的傳質傳熱，并增加攪拌的能量消耗[23]。若粘度較大，發酵效果和設備利用率將降低，不利于后續工作的進行，增加溶劑分離的難度。對S3發酵液的粘度進行考察，發現其粘度由原始菌的 10 mPa·s減小到4 mPa·s，降低了 60%；這將便于溶劑分離和發酵工作的展開，從而減少發酵成本。

2.4 S3與C. acetobutylicum L7的丁醇耐性

微生物發酵法生產生物燃料時例如乙醇、1-丙醇等，目標產物通常會對菌體產生很大的毒害作用，影響菌體生長。丁醇發酵中，丁醇因其疏水性 (離液序列高) 堆積在細胞膜表面，干擾膜功能，其通透性和流動性增加，使ATP、離子、磷脂、RNA、蛋白等流失，破壞適合菌體生長的pH，影響胞內新陳代謝和能量的運輸及轉換，加速了菌體的死亡[5,24-25]。丁醇的毒性作用限制了發酵液中丁醇的濃度，增加后期的分離成本。因此對S3的丁醇耐性進行了考察，如圖6所示不同丁醇濃度下 (0、6、12、14 g/L)，C. acetobutylicum L7與S3菌體的生長情況。

圖6 不同丁醇濃度下原始菌與S3的生長情況Fig. 6 Growth profles of C. acetobutylicum L7 and S3 challenged with different concentration of butanol. (A) 0 g/L butanol. (B) 6 g/L butanol. (C) 12 g/L butanol. (D) 14 g/L butanol.

從圖中可以看出，在添加丁醇的情況下，S3的生長均強于原始菌，同時間點OD620一直較原始菌大，表現出較強的丁醇耐受力。原始菌在12 g/L丁醇中，起初能夠維持生長，最大OD620為1.39；之后因其丁醇耐受低，菌體大量死亡。在添加14 g/L丁醇濃度下，S3菌體OD620緩慢增加，最大為 1.41；而原始菌無法存活，OD620一直減小，得出S3的丁醇耐受濃度比原始菌高，分別為14 g/L和12 g/L。

丁醇對C. acetobutylicum的毒害作用相當嚴重。無丁醇的培養基中，原始菌和S3生長良好，最大OD620各為2.43、2.46；含有丁醇的情況下，原始菌與S3的生長受到明顯抑制，菌體增殖緩慢，最大OD620都未能達到2.4；并且4種丁醇濃度下，出現正增殖的時間逐漸縮短，分別為：原始菌12 h，12 h，6 h，0；S3 15 h，15 h，9 h，6 h。在耐受丁醇極限濃度下 (原始菌 12 g/L，S3 14 g/L)，OD620只能增殖到1.40，比無丁醇濃度下減小42.9%?？梢缘贸?，丁醇毒性嚴重影響了菌體的生長代謝。文獻指出[26-27]，丁醇作用下，菌體細胞膜的組成發生很大改變；菌體不能維持內部pH，ATPase活性降低。基于此，下一步可對S3進行丁醇耐性機理的探索，并提出提高丁醇耐受程度的策略，為進一步提高丁醇產量奠定基礎。

3 結論

本研究首次使用鏈霉素誘變 C. acetobutylicum L7提高丁醇產量。篩選獲得的菌株，丁醇產量提高率均超過10%；其中S3產量最高，達到12.48 g/L，丁醇耐受程度也有顯著提高，表明核糖體工程技術在篩選丁醇高產菌株方面有效、可行。通過分析比較 S3與C. acetobutylicum L7發酵性能差異，推測S3的丁醇及乙醇代謝通量有可能發生變化，后續研究工作將對菌株S3的抗性突變、丁醇耐受機理及代謝通路作進一步的研究，為更大程度提高丁醇產能提供技術支持。

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