絲狀真菌Amorphotheca resinae ZN1的糠醛降解代謝分析

王曉鳳，張 建，辛秀娟，鮑 杰

華東理工大學生物工程學院 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237

絲狀真菌Amorphotheca resinae ZN1的糠醛降解代謝分析

王曉鳳，張 建，辛秀娟，鮑 杰

華東理工大學生物工程學院 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237

木質纖維素在預處理過程產生的降解產物對后續的酶水解和微生物發酵過程產生了強烈的抑制。因此，這些抑制物的脫除即所謂的“脫毒”步驟是正常進行后續酶解和發酵的前提條件。我們對本實驗室篩選的絲狀真菌Amorphotheca resinae ZN1的糠醛的代謝路徑進行了研究。絲狀真菌A. resinae ZN1轉化糠醛的降解代謝途徑可以簡述為：糠醛首先快速地轉化為毒性較低的糠醇；在有氧條件下，糠醇又再度生成不致對微生物產生危害的低濃度糠醛，糠醛繼續氧化為糠酸。推測糠酸可能繼續進入TCA循環，進而完成糠醛的完全降解。研究結果為將來加快絲狀真菌A. resinae ZN1生物脫毒速率、改善木質纖維素生物轉化的限速步驟提供了重要的實驗依據。關鍵詞: 降解途徑，生物脫毒，糠醛，木質纖維素

在木質纖維素的生物轉化過程中，預處理是破壞木質纖維素致密結構、提高纖維素酶解效率的必需步驟[1]。高溫、強酸或強堿的預處理在破壞木質纖維素結構的同時，不可避免地生成了多種對后續酶解和微生物發酵過程具有強烈抑制作用的降解產物，主要包括有機酸類化合物、呋喃類化合物和酚類化合物[2-6]，因此，要實現對木質纖維素的有效生物轉化，必須對預處理后的原料進行脫毒處理。

目前常用的脫毒方法有水洗法[7]、過堿化處理 (Overliming)[8]、活性炭或離子交換樹脂吸附[9]、真空蒸發[2]以及生物降解等[10-13]。這些方法中具有實際應用價值的僅有水洗法和過堿化方法，但都存在著大量耗水和大量廢水產生、物料損失嚴重、處理后物料高含水等嚴重問題[14]。與其他脫毒方法相比，生物脫毒法條件溫和、抑制物轉化徹底、耗能低且廢水少，而且脫毒后的物料可以直接進入乙醇發酵，但脫毒效率低[15-16]是制約生物脫毒法廣泛應用的核心問題。因此，得到一株能夠高效降解各種抑制物的微生物是生物脫毒法的關鍵[17]。

糠醛由于含有呋喃環，不易受到代謝過程的破壞，生物降解較為緩慢。Gerhard等從含有亞硫酸鹽的連續發酵罐中分離出了一株能夠轉化糠醛的菌株Desulfovibrio sp. F-1[18]。這株菌能夠在無機鹽和生長因子受限制的硫酸鹽培養基中，以糠醛作為唯一的碳源和能源生長，得率為1.6~1.8 mmol乙酸/mmol糠醛。Mohammad等對有氧及厭氧情況下的馴化釀酒酵母CBS 8066降解糠醛進行了研究[19]，在有氧或者厭氧的分批發酵中，糠醛主要代謝為糠醇 (產率約為70%)，而且在指數期生長期代謝能力最強，穩定期較弱；糠醛使酵母的比生長速率和乙醇產率下降，而當糠醛完全代謝完后有所回升。Belay等對一株產甲烷球菌屬的突變株Methanococcus deltae LH厭氧轉化糠醛進行了研究[20]，該菌株代謝糠醛的主要產物是糠醇，同時生成甲烷和二氧化碳氣體，但它不能以糠醛為唯一碳源及能源生長。Nichols等從被糠醛污染過的土壤中分離到了一種可以代謝呋喃衍生物、有機酸以及酚類化合物的真菌Coniochaeta ligniaria NRRL30616，可以把毒性強的糠醛轉化為弱毒性的相應醇的形式，即糠醇，然后再氧化為相應的酸，從而使得酵母的后續發酵生產乙醇得以進行[21]。

近兩年，荷蘭Delft University of Technology的一個研究組對糠醛的代謝路徑進行了較為深入的研究。Wierckx等從土壤中分離獲得的Cupriavidus basilensis HMF14能夠代謝轉化5-羥甲基糠醛和糠醛，但卻不能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖以及甘露糖[22]；進一步的代謝路徑研究表明，C. basilensis HMF14代謝糠醛的產物分別是糠醇和糠酸，并最終進入支持細胞生長的代謝路徑；在這3種呋喃衍生物中，糠醛對微生物的毒性最大，因此在微生物轉化糠醛時，首先將它快速地轉化為糠醇，從而使糠醛含量保持在一個低水平濃度范圍內，然后再分批少量地通過將其氧化為糠醛作為過渡階段，最終將其氧化為糠酸，通過細胞攝入，將糠酸大量地運輸到細胞中，支持菌體生長，因此在這個過程中，糠醛、糠醇和糠酸是相互轉化的，且這個過程中只能看到少量的糠酸積累。Koopman等建立了C. basilensis HMF14的突變體轉座子文庫，鑒定出了呋喃衍生物代謝途徑涉及的基因，并在假單胞菌Pseudomonas putida體內重構了糠醛和5-羥甲基糠醛的代謝途徑[23]。

Zhang等從稀酸預處理后的玉米秸稈中篩選到了一株脫毒真菌Amorphotheca resinae ZN1，并對其作了分子生物學和微生物學鑒定，而且在玉米秸稈發酵乙醇過程中得到了有效利用[15]。本實驗主要是以糠醛作為唯一碳源對這一煤油真菌A. resinae ZN1的抑制物代謝路徑進行了研究。所提出的煤油真菌A. resinae ZN1轉化糠醛的降解代謝途徑跟前人提出的細菌中的代謝途徑基本一致，糠醛首先快速地轉化為毒性較低的糠醇，糠醇又再度生成不致對微生物產生危害的低濃度糠醛，糠醛繼續氧化為糠酸。推測糠酸的進一步降解路徑可能與其他微生物類似[23]，通過進入TCA循環完成糠醛的完全降解。研究結果對將來加快煤油真菌A. resinae ZN1生物脫毒速率、改善木質纖維素生物轉化的限速步驟提供了重要的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥品

糠醛購自上海德默化學技術有限公司 (上海，中國)，糠醇和糠酸購自國藥集團化學試劑有限公司 (上海，中國)。磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、氯化鈣購自上海凌峰化學試劑有限公司(上海，中國)，酵母提取物購自Oxoid Ltd (Basingstoke Hampshire，England)。所有試劑和藥品均為分析純。

1.2 脫毒菌株及培養

脫毒菌種為本實驗室篩選和保存的Amorphotheca resinae ZN1，該菌的分子生物學和微生物學鑒定見文獻[8]。A. resinae ZN1菌株在PDA試管斜面保存和傳代。PDA培養基的制備簡述：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 000 mL。煮沸l h，用8層紗布過濾，然后補足水至1 L，并添加葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，121 ℃滅菌20 min，貯存備用。該培養基為菌株的傳代保存培養基。

1.3 A. resinae ZN1的培養和發酵

種子培養基：KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl20.5 g/L，酵母提取物1 g/L，葡萄糖40 g/L。

發酵培養基：KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl20.5 g/L，酵母提取物1 g/L，葡萄糖20 g/L。滅菌后分別添加過濾除菌的糠醛 (約0.6 g/L)。

無機鹽培養基：KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl20.5 g/L。滅菌后加入過濾除菌的糠醛 (約0.6 g/L)。

發酵菌種的培養：用無菌水從培養好的PDA斜面試管洗下孢子懸液，然后按照10% (V/V)的接種量接入含有種子培養基的三角瓶中，置于28 ℃的恒溫培養箱里靜止培養3 d。

發酵操作是在3 L發酵罐 (保興生物科技有限公司，上海，中國) 中進行的，裝液量為1 L，20% (V/V) 接種量，溫度26 ℃，轉速100 r/min，并通過調節通氣量來控制不同的溶氧水平。在發酵過程中，用2 mol/L的HCl和NaOH維持發酵體系的pH在5.5，并不時取樣，取樣后立即用0.22 μm的濾膜過濾樣品，然后保存在4 ℃的冰箱，以備后續的分析。

1.4 分析方法

呋喃衍生物 (包括糠醛、糠醇、糠酸) 通過RP-HPLC (Reversed-phase HPLC，LC-20AT，UV/VIS detector SPD-20A；Shimadzu，Kyoto，Japan) 和GC-MS (QP5000，Shimadzu，Agilent 19091S-433) 進行定性分析，并用RP-HPLC進行定量分析。

RP-HPLC的配置和工作條件為：YMC-Pack ODS-A柱 (LC-20AT，UV/VIS detector SPD-20A；Shimadzu，Toyoto，Japan)，流動相流速1 mL/min；進樣量20 μL；柱溫35 ℃，流動相為乙腈∶超純水=50:50；檢測波長為：糠醛、糠醇和糠酸為220 nm。

葡萄糖和乙酸是通過HPLC (LC-20AD，refractive index detector RID-10A；Shimadzu，Toyoto，Japan)測定的。HPLC的配置和工作條件為：Bio-Rad HPX-87H柱，流動相為5 mmol/L硫酸，柱溫為65 ℃流速為0.6 mL/min。所有從發酵罐中取的樣品，進樣前均在14 000 r/min的條件下離心7 min，并通過0.22 μm的濾膜過濾。以上所有糠醛代謝過程均有兩個重復實驗。

圖1 A. resinae ZN1以糠醛為唯一碳源的代謝轉化Fig. 1 Metabolism of furfural as the sole carbon source by A. resinae ZN1. Conditions: 20% incaution, 26 °C, pH 5.5, 100 r/min, ventilation of 0.91 vvm.

2 結果與分析

2.1 A. resinae ZN1的糠醛代謝分析

為了更清楚地了解A. resinae ZN1生物脫除糠醛的代謝路徑，也為了驗證糠醛能否作為絲狀真菌A. resinae ZN1的唯一碳源，本研究采用了含糠醛的無糖無機鹽離子培養基。種子擴培后用500 mL的無菌水洗菌膜2次，將洗去殘糖的菌膜接種到含糠醛的無糖無機鹽離子培養基中進行發酵，結果見圖1。該實驗是采用的無糖無機鹽離子培養基對A. resinae ZN1進行培養，從培養情況來看，A. resinae ZN1依然可以很好地進行生長繁殖，從接種發酵開始到糠醛轉化期間，發酵罐內從剛開始接種的少量菌片到發酵罐內壁周圍貼滿黑色的成片狀菌絲、發酵罐攪拌槳上纏滿菌絲片，發酵液從初始的澄清透亮狀態到發酵液變成黑色、渾濁狀態，菌體生物量大量增加。但是，由于菌體生長的不規則性，準確地定量測定生物量較為困難。從圖1可以看出，糠醛可以作為A. resinae ZN1的唯一碳源及能源進行生長和發酵，首先，糠醛快速地向糠醇轉化，隨后進一步轉化為糠酸。由于糠酸可以順利進入后續的代謝步驟，糠酸積累不顯著，并最終被完全代謝，所以在代謝進行到42 h后，已經看不到糠酸的積累；而糠醛還原為糠醇的速度要遠遠快于糠醇進一步氧化的速度，所以在糠醛快速轉化的階段(16 h至42 h之間)，糠醇的積累量要大于糠酸的積累量。對于微生物而言，糠醛對其生長的抑制作用最大，而糠醇的毒性最弱，A. resinae ZN1將高濃度的糠醛先快速地還原為糠醇，在一定程度上就大大減弱了糠醛對其生長的強抑制作用，然后再將弱毒性的糠醇進一步氧化為糠酸，并將之徹底代謝掉。在有氧狀態下，A. resinae ZN1不需要特殊的營養因子可以很好地降解糠醛。A. resinae ZN1可以以少數幾種無機鹽作為營養代謝糠醛，表現出了與以往研究中脫毒菌種所不具有的獨特性質[18,24]。

溶氧水平對真菌的液體培養非常重要。本研究對不同溶氧水平的A. resinae ZN1代謝糠醛的情況進行了考察，結果見圖2。圖2中糠醛的轉化曲線error bar跨度比較大，分析原因可能是由于菌種接種時的生長狀態存在一定差異。本文中的保藏菌種是在PDA試管斜面培養基上培養的，斜面上菌種的生長狀態很難測定其生長曲線，每批種子接種時的生長狀態可能不同，因此A. resinae ZN1對糠醛的轉化速率可能會存在一定差異。

分析圖2A可知，不通空氣時，糠醛轉化和糠醇生成速率較慢，而且生成糠醇后幾乎不向糠酸轉化，也檢測不到糠酸的積累。由于糠醇對微生物的毒性很小，生物脫毒進行到這一步，即可以進行下一步的酶解和乙醇發酵過程。由此可見，A. resinae ZN1可以在厭氧狀態下進行生物脫毒。圖2A還表明，在糠醛代謝完全之前葡萄糖幾乎不消耗，而在糠醛被完全代謝后，葡萄糖的消耗速度大大加快，表明當有抑制物存在時，A. resinae ZN1優先轉化其生長抑制物。

分析圖2B可知，在較低的溶氧狀態下(0.45 vvm)，糠醛轉化和糠醇生成速率顯著增加，并出現有糠酸積累的階段。與厭氧狀態下糠醛代謝一致的是，糠醛首先快速轉為毒性較低的糠醇，然后再氧化成為糠酸，而氧的存在是糠醇進一步快速氧化為糠酸的必要條件。在糠醛被完全轉化前，葡糖糖的消耗速度不大；當糠醛被完全轉化為糠醇后，葡萄糖的消耗速度大大增加。

分析圖2C可知，在較高的溶氧水平下(1.88 vvm)，糠醛的轉化非常迅速，而由于高溶氧的存在，糠醇向糠酸的轉化也更為快速；而且糠醇和糠酸積累的階段持續時間很短。高溶氧條件下的葡萄糖利用情況與低溶氧狀態時相近。

圖2 不同溶氧水平下A. resinae ZN1對糠醛的代謝狀況Fig. 2 Influence of metabolic mechanism of furfural degradation by the kerosene fungus strain, A. resinae ZN1 at different oxygen dissolved levels. Conditions: 20% incaution, 26 °C, pH 5.5, 100 r/min.

上述實驗結果表明，溶氧在糠醇向糠酸轉化過程中起著至關重要的作用，較高的溶氧不僅可以促進糠醇向糠酸的轉化，而且有利于糠酸在胞內被徹底代謝為終產物。溶氧雖然不是A. resinae ZN1進行糠醛降解的限制因素，但卻是糠醇進一步向糠酸氧化的重要條件；溶氧可以顯著影響糠醛降解的速率，尤其是糠醇向糠酸氧化以及糠酸后續代謝的速率。提高溶氧水平可以大大加快A. resinae ZN1進行糠醛脫除的速率。

為了進一步確定溶氧在糠醛轉化過程中的作用，本研究設計了一個兩階段通氣法來研究溶氧對糠醛轉化的影響，所用培養基為發酵培養基，成分如下：KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl20.5 g/L，酵母提取物1 g/L，葡萄糖20 g/L。滅菌后分別添加過濾除菌的糠醛 (約0.6 g/L)。滅菌后添加過濾除菌的糠醛 (約0.6 g/L)。兩階段通氣法是指在發酵開始前，先通入足量的氮氣，以置換發酵液中的溶解氧，在發酵開始后、糠醛完全轉化的這段時間內，不通空氣，即在糠醛完全轉化的這段時間內是完全厭氧培養，之后則以0.91 vvm的通氣量通入空氣進行有氧培養 (圖3)。分析圖3可知，厭氧培養時糠醛緩慢地向糠醇轉化，在糠醛完全轉化為糠醇并開始有氧培養時，糠醇開始向糠酸氧化。與圖2不同的是，兩階段通氣法中糠醛是在完全厭氧的環境中還原的，此時糠醇的生成速率很慢，糠酸的積累一直很少。原因可能是由于A. resinae ZN1在長時間的厭氧生長狀態下，細胞活力大大下降，即使重新開始通氣進行有氧培養，糠醇的氧化速度依然很慢，糠酸的利用速度也很慢。結合圖2中的實驗結果，有氧培養是提高細胞活力進而提高生物脫毒速率的有效途徑。

圖3 兩階段通氣法對A. resinae ZN1代謝糠醛的影響Fig. 3 Influence of metabolic mechanism of furfural degradation by A. resinae ZN1 with the control method of the second stage. The experiment conditions: 20% incaution, 26oC, pH 5.5, 100 r/min.

2.4 A. resinae ZN1降解糠醛代謝路徑的初步解析

綜合上述實驗結果，本文對絲狀真菌A. resinae ZN1轉化糠醛和5-羥甲基糠醛的降解代謝途徑進行了分析，結果見圖4。糠醛首先在醛還原酶作用下快速地轉化為毒性較低的糠醇；然后糠醇在醇脫氫酶作用下，再度生成不致對微生物產生危害的低濃度糠醛；然后，糠醛在醛脫氫酶作用下，繼續氧化為糠酸。推測糠酸的進一步降解路徑可能與Koopman等[23]提出的Cupriavidus basilensis HMF14代謝路徑相似，通過進入TCA循環完成糠醛的完全降解，即糠酸在糠酰輔酶A合成酶的作用下，結合一分子的HSCoA轉化為2-糠酰輔酶A (2-Furoyl-CoA)；在鉬依賴糠酰輔酶A脫氫酶的作用下，結合一分子水后轉化為5-羥基-2-糠酰-輔酶A；通過酮-醇互變異構化，以及自發的內酯水解或者在一般的內酯水解酶的作用下轉化為2-氧化戊二酸和輔酶A，2-氧化戊二酸最終進入TCA循環。

本研究推測，A. resinae ZN1的糠醛生物降解路徑與前人提出的細菌中的代謝途徑基本一致[23,25]。在本研究中，無論是厭氧狀態還是有氧發酵，均發現糠醛也是被A. resinae ZN1的細胞攝取并且進行轉化的，我們分析，發酵液中糠醛的減少應該是被A. resinae ZN1的細胞一點一點地攝入細胞內，胞外的糠醛濃度才逐漸降低，然后糠醛被快速地還原為糠醇后，高濃度的糠醇又被分泌到胞外，從而能在胞外檢測到。我們認為，A. resinae ZN1的細胞是定量分批地攝入糠醛，并分泌糠醇的。因此，糠醛是被A. resinae ZN1的細胞攝取并在胞內轉化的，其轉化產物分別是糠醇、糠酸?？紤]到糠醛的高生物毒性，A. resinae ZN1首先是將其進行快速地還原為較弱生物毒性的糠醇，然后再進行氧化反應，將高毒性抑制物的濃度維持在不影響A. resinae ZN1細胞正常生長的水平，這種脫毒方式被認為是經典的非特異性的呋喃醛脫毒機制[22]。中間產物糠醇的大量積累充當無毒性的底物泵，以供糠酸的氧化生成，糠酸是A. resinae ZN1細胞進行生長的實際底物。在本文的各項實驗中，糠酸的濃度一直都不高，說明糠酸被A. resinae ZN1的細胞作為碳源以供生長繁殖所需。

本文中絲狀真菌A. resinae ZN1對糠醛的降解代謝分析的結論只是初步的研究，準確的代謝路徑確認還需要更多的實驗數據和代謝組學研究支持。后續的工作包括A. resinae ZN1對木質纖維素預處理后的有機酸類 (乙酸、甲酸、乙酰丙酸等)、苯酚類衍生物 (香蘭素、對羥基苯甲醛等) 的代謝路徑分析，以及在全基因組測序基礎上的熒光定量PCR和生物芯片分析等，最終的目標是將這一生物脫毒技術應用于真實木質纖維素加工過程，提高木質纖維素生物煉制的過程效率、降低纖維素乙醇的成本。

圖4 A. resinae ZN1的糠醛生物降解路徑[23]Fig. 4 Biodegradation pathway of furfural by A. resinae ZN1[23].

3 結論

本研究中的絲狀真菌A. resinae ZN1在厭氧或者有氧狀態下均可以很好地降解木質纖維素預處理后產生的呋喃抑制物糠醛。絲狀真菌A. resinae ZN1轉化糠醛的降解代謝途徑跟前人提出的細菌中的代謝途徑基本一致：糠醛首先快速地轉化為毒性較低的糠醇，糠醇則再度生成不致對微生物產生危害的低濃度糠醛，糠醛繼續氧化為糠酸。推測糠酸可能繼續進入TCA循環，進而完成糠醛的完全降解。結果為將來加快絲狀真菌A. resinae ZN1生物脫毒速率、改善限速步驟提供了重要的實驗依據。

REFERENCES

[1] Stricker AR, Mach RL, Graaff LH. Regulation oftranscription of cellulases and hemicellulasesencoding genes in Aspergillus niger and Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei). Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(2): 211?220.

[2] Larsson S, Reimann A, Nilvebrant NO, et al. Comparison of different methods for the detoxification of lignocellulose hydrolysates of spruce. Appl Biochem Biotechnol, 1999, 77(1/3): 91?103.

[3] J?rgensen H, KristensenJB, FelbyC. Enzymatic conversion of lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities. Biofuels Bioprod Bioref, 2007, 1(2): 119?134.

[4] Almeida JR, Modig T, Petersson A, et al. Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae. J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82(4): 340?349.

[5] Klinke HB, Thomsen AB, Ahring BK. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 66(1): 10?26.

[6] Jing XY, Zhang XX, Bao J. Inhibition performance of lignocellulose degradation products on industrial cellulase enzymes during cellulose hydrolysis. Appl Biochem Biotechnol, 2009, 159(3): 697?707.

[7] Palmqvist E, Hahn-H?gerdal B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. I.Inhibition and detoxification. Bioresour Technol, 2000, 74(1): 17?24.

[8] Martinez A, Rodriguez ME, Wells ML, et al. Detoxification of dilute acid hydrolysates of lignocellulose with lime. Biotechnol Progr, 2001, 17(2): 287?293.

[9] J?nsson LJ, Palmqvist E, Nilvebrant NO, et al. Detoxification of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49(6): 691?697.

[10] Yu J, Stahl H. Microbial utilization and biopolyester synthesis of bagasse hydrolysates. Bioresour Technol, 2008, 99(17): 8042?8048.

[11] Nichols NN, Dien BS, Cotta MA. Fermentation of bioenergy crops into ethanol using biological abatement for removal of inhibitors. Bioresour Technol, 2010, 101(19): 7545?7550.

[12] J?nsson LJ, Palmqvist E, Nilvebrant NO, et al. Detoxification of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49(6): 691?697.

[13] Nichols NN, Dien BS, Guisado GM, et al. Bioabatement to remove inhibitors from biomass-derived sugar hydrolysis. Appl Biochem Biotechnol, 2005, 121: 379?390.

[14] Dong HW, Bao J. Biofuel via biodetoxification. Nat Chem Biol, 2010, 5(6): 317?318.

[15] Zhang J, Zhu ZN, Wang XF, et al. Biodetoxification of toxins generated from lignocellulose pretreatment using a newly isolated fungus, Amorphotheca resinae ZN1, and the consequent ethanol fermentation. Biotechnol Biofuels, 2010, 3: 26.

[16] Zhang J, Chu DQ, Yu ZC, et al. Process strategy for ethanol production from lignocellulose feedstock under extremely low water usage and high solids loading conditions. Chin J Biotech, 2010, 26(7): 950?959.張建, 楚得強, 于占春, 等. 低水用量約束條件下的高固體含量纖維乙醇生物加工技術策略. 生物工程學報, 2010, 26(7): 950?959.

[17] Converti A, Perego P, Domínguez JM. Xylitol production from hardwood hemicellulose hydrolyzates by Pachysolen tannophilus, Debaryomyces hanseniie, and Candida guilliermondii. Appl Biochem Biotechnol, 1999, 82(2): 141?151.

[18] Brune G, Schoberth SM, Sahm H. Growth of a strictly anaerobic bacterium on furfural (2-furaldehyde). App1 Environ Microbio1, 1983, 46(5): 1187?1192.

[19] Taherzadeh MJ, Gustafsson L, Niklasson C, et al. Conversion of furfural in aerobic and anaerobicbatch fermentation of glucose by Saccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng, 1999, 87(2): 169?174.

[20] Belay N, Boopathy R, Voskuilen G. Anaerobic transformation of furfural by Methanococcus deltae (Delta) LH. App1 Environ Microbio1, 1997, 63(5): 2092?2094.

[21] Nichols NN, Sharma LN, Mowery RA, et al. Fungal metabolism of fermentation inhibitors present in corn stover dilute acid hydrolysate. Enzyme Microb Technol, 2008, 42(7): 624?630.

[22] Wierckx N, Koopman F, Luaine B, et al. Isolation and characterization of Cupriavidus basilensis HMF14 for biological removal of inhibitors from lignocellulosic hydrolysate. Microbial Biotechnol, 2010, 3(3): 336?343.

[23] Koopman F, Wierckx N, Johannes HW, et al. Identification and characterization of the furfural and 5-(hydroxymethyl) furfural degradation pathways of Cupriavidus basilensis HMF14. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(11): 4919?4924.

[24] Boopathy R, Bokang H, Daniels L. Biotransformation of furfural and 5-hydroxymethyl furfural by enteric bacteria. J Ind Microbiol, 1993, 11(3): 147?150.

[25] Nichols NN, Mertens JA. Identification and transcriptional profiling of Pseudomonas putida genes involved in furoic acid metabolism. FEMS Microbiol Lett, 2008, 284(1): 52?57.

Furfural degradation by filamentous fungus Amorphotheca resinae ZN1

Xiaofeng Wang, Jian Zhang, Xiujuan Xin, and Jie Bao
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Some degradation products from lignocellulose pretreatment strongly inhibit the activities of cellulolyticenzymes and ethanol fermentation strains, thus the efficient removal of the inhibitor substances (“detoxification”) is the inevitable step for the biotransformation processes. In this study, the biological detoxification of furfural by a newly isolated fungus, Amorphotheca resinae ZN1, was studied and the metabolic pathways of furfural degradation was analyzed. The metabolic pathway of furfural degradation in A. resinae ZN1 was described as follows: first, furfural was quickly converted into the low toxic furfuryl alcohol; then the furfuryl alcohol was gradually converted into furfural again but under the low concentration under aerobic condition, which was not lethal to the growth of the fungi; furfural continued to be oxidized to furoic acid by A. resinae ZN1. It is likely that furoic acid was further degraded in the TCA cycle to complete the biological degradation of furfural. The present study provided the important experimental basis for speeding up the biodetoxification of furfural by A. resinae ZN1 and the rate-limiting step in the lignocellulose biotransformation to ethanol.

metabolic pathway, biodetoxification, furfural, lignocellulose

January 18, 2012; Accepted: June 13, 2012

Jie Bao. Tel: +86-21-64251799; E-mail: jbao@ecust.edu.cn

王曉鳳, 張建, 辛秀娟, 等. 絲狀真菌Amorphotheca resinae ZN1的糠醛降解代謝分析. 生物工程學報, 2012, 28(9): 1070?1079.

Wang XF, Zhang J, Xin XJ, et al. Furfural degradation by filamentous fungus Amorphotheca resinae ZN1. Chin JBiotech, 2012, 28(9): 1070?1079.

Supported by: National Basic Research Program of China (No. 2011CB707406), National Natural Science Foundation of China (No. 20976051), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2011M500742), Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (No. WF0913005), Shanghai Leading Academic Discipline Project (No. B505).

國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (No. 2011CB707406)，國家自然科學基金 (No. 20976051)，中國博士后基金 (No. 2011M500742)，中央高?；究蒲袠I務費專項資金 (No. WF0913005)，上海市重點學科建設項目 (No. B505) 資助。