抑癌基因DLC-1與結腸癌的關系＊

劉 洪，王春毅 綜述，傅仲學審校

（重慶醫科大學附屬第一醫院胃腸外科 400016）

結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發生、發展和演進是一個多步驟、多因素綜合作用的復雜生物學過程，涉及到許多基因表達的異常。目前研究發現，某些抑癌基因的表達抑制是觸發結腸癌的重要機制。腫瘤抑癌基因已成為分子生物學研究的熱點和前沿。這一領域的研究對最終揭開結腸癌發生、發展的機制，實現結腸癌的基因靶向治療，具有重大的理論和臨床意義。尋找結腸癌相關的特異性抑癌基因，可進一步從分子水平闡明結腸癌的發病機制，為結腸癌的診斷和治療等提供新的依據。DLC-1即是一種近幾年研究較多的抑癌基因，涉及了結腸癌等多種惡性腫瘤的發病機制。本文就DLC-1的結構、生物學功能、在結腸癌中的失活機制和在結腸癌發生、發展中的作用作一綜述。

1 DLC-1的結構及生物學功能

DLC-1（deleted in liver cancer-1）又 名 ARHGAP7 或STARD12，全稱為肝癌缺失基因。1998年，Yuan［1］等在對多個肝癌細胞系的8號染色體的研究中，采用以PCR為基礎的減除雜交技術－再現差異分析法（representational difference analysis，RDA）首次在人肝細胞癌（HCC）和HCC細胞株中發現OLC-1。隨后研究發現，DLC-1在結腸癌等多種腫瘤中也存在表達缺失［2］。

人類DLC-1位于染色體8p21.3～22.0區，這一區域在結腸癌等多種惡性腫瘤中經常發生基因表達的缺失或下調。DLC-1cDNA全長3 850bp，含有14個外顯子，表達蛋白由1 091個氨基酸組成，蛋白相對分子質量為123×103［1］，DLC-1蛋白主要定位于細胞質中。DLC-1基因序列與鼠p122RhoGTP酶激活蛋白（p122RhoGAP）基因序列有86%相同，表達蛋白有92.5%相同，故被認為二者具有同源性，這一點也在一定程度上為研究DLC-1基因提供了佐證。隨后DLC-1的兩種同源分子DLC-2和DLC-3被發現，它們同DLC-1一樣也有抑制腫瘤的作用。

DLC-1蛋白具有的3個重要的功能結構域：Rho GAP酶激治蛋白（Rho GTPase activating protein，RhoGAP）、類固醇急性調節相關脂質轉移域（steroidogenic acute regulatory related lipid transfer domains，START）和山姆結構域（sterile alpha motif，SAM）。除此之外，在SAM和RhoGAP結構域之間含有一段富含絲氨酸的區域，存在一個黏著斑定位序列（focal adhesion targeting sequence）［3］，見圖1。

1.1 RhoGAP結構域 RhoGAP能通過特異性增強Rho家族蛋白自身內源性的GTP酶水解活性，促進無活性的RhoG-DP生成，因此扮演了Rho家族蛋白負調控因子的角色，在DLC-1的腫瘤抑制功能中發揮重要作用，故DLC-1又被稱為ARHGAP7。RhoGAP結構域可能是DLC-1基因抗腫瘤的主要機制［5］，人類對DLC-1的抑癌功能猜測最初也是源于該結構域。

Rho家族蛋白是Ras超家族的小G蛋白，其下游效應分子包括70多種蛋白激酶、磷脂酶以及支架蛋白［6］。基于其效應分子的多樣性，Rho家族蛋白成為細胞內多條信號轉導通路的關鍵成分，對細胞的多種生物學行為起調控作用，可參與調節細胞骨架，維持細胞形態、極性、細胞運動，并在細胞增殖、分化、凋亡中起關鍵作用，與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關，是Ras通路介導的致瘤性轉化的重要成員之一［7］。

已發現的人類Rho家族蛋白共有23種，最具代表性的是RhoA、Racl和Cdc42，這3種蛋白在細胞運動、轉移和細胞骨架形成過程中起十分關鍵的作用。研究證明DLC-1能明顯提高RhoA和Cdc42的內在GTP酶活性，但并不使Rac1的GTP酶活性增加［8］。Healy［9］等發現 DLC-1對該 家族成員RhoB和RhoC的GTP酶活性也有增強作用。

Rho家族蛋白受RhoGAP、鳥嘌呤核昔酸交換因子（GEFs）、鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子（GDIs）3種調節蛋白調控。RhoGAP使GTP水解成GDP而失活；GEFs催化Rho蛋白的GDP／GTP交換而正相調控Rho蛋白活性；GDIs能與GDP-Rho復合物結合使之穩定，二者結合后定位于胞漿，以抑制GDP／GTP交換［10］。GEFs和RhoGAP的動態平衡是Rho蛋白向細胞內傳遞正常生長信號的前提，如果Rho家族信號通路發生改變，如DLC-1基因失活將使Rho蛋白的表達異常，從而激活一系列腫瘤信號，這可能是腫瘤發病的主要機制之一。

1.2 START結構域 START結構域存在于StAR、HD-ZIP和其他信號蛋白，是蛋白質的脂質結合域，在細胞器之間起傳輸脂類的作用。DLC-1的START結構域位于其C－端，故DLC-1又被稱為STARD12。研究發現，DLC-1的START結構域抑制動蛋白應力纖維形成和成長，在調解細胞的形變及運動中起重要作用［3］。另外，DLC-1的START結構域可能參細胞內部脂質運輸和代謝［11］，其功能有待進一步研究證實。

1.3 SAM結構域 SAM結構域位于DLC-1的N-端，相互作用能形成同源二聚體或多聚體，也可以結合其他不含SAM結構域的蛋白、DNA或RNA。研究發現，SAM結構域參與調解細胞形變及運動［12］，也可能抑制自身RhoGAP結構域的活性［9］，其具體功能尚不清楚。

1.4 黏著斑定位序列 黏著斑定位序列使DLC-1蛋白可以結合張力蛋白和肌動蛋白上的SH2結構域，在黏著斑定位以及腫瘤抑制中起重要作用。SH2是磷酸酪氨酸的結合基序，然而通過酵母雙雜交、亞細胞定位、免疫共沉淀等方法分析發現，DLC-1和SH2結構之間的相互作用不需要DLC-1的酪氨酸磷酸化［13］。黏著斑參與細胞與細胞外基質的黏附，提示DLC-1在腫瘤的轉移中起作用。同時，黏著斑定位序列對RhoGAP活性有重要的調節作用［3］。

1.5 DLC-1的 C端 鼠 DLC-1的 C－端和 PLCδ1作用，增強PLCδ1的磷酸肌醇二磷酸（PIP2）的水解活性，PIP2水解可生成二酯酰基甘油和三磷酸肌醇，分別激活細胞內的蛋白激酶C和觸發細胞內鈣離子的釋放，后二者是肌動蛋白細胞骨架的調節者，從而調節肌動蛋白的細胞骨架［13］。但在對人類非小細胞肺癌（NSCLC）進行研究時發現，人的DLC-1蛋白不具有激活 PLCδ1的水解活性［9］。

DLC-1的C－端還含有小窩蛋白1（caveolin-1）的結合基序，與具有同樣結合基序的張力蛋白2一起，通過結合小窩蛋白l而定位于細胞膜穴樣凹陷及黏著斑等處［14］。DLC-l和張力蛋白2還可相互作用形成復合物，共同抑制Ras信號系統，若DLC-1的小窩蛋白1結合基序發生突變，抑制活性便喪失。DLC-1、張力蛋白2、小窩蛋白1三者之間的相互作用，可能是DLC-1抗癌的另一種機制。

DLC-1尚參與調節胰島素信號轉導通路。Hers等［15］研究發現，鼠DLC-1（p122RhoGAP）是蛋白激酶B的作用底物，胰島素刺激可使p122RhoGAP的絲氨酸-322（人DLC-1色氨酸-329）被蛋白激酶B和核糖體S6激酶磷酸化，從而參與細胞內一系列信號傳導。

2 DLC-1基因在結腸癌中失活機制的研究

Yuan和Durkin［16］發現 DLC-1mRNA在人體各正常組織中正常表達，但在結腸癌等多種腫瘤組織中常發生表達缺失。Ullmannova和Popescu［17］通過癌癥陣列分析也發現DLC-1在結腸癌中發生表達缺失或下調。目前關于DLC-1基因失活機制的研究主要包括啟動子區域甲基化、雜合性丟失。

2.1 雜合性丟失 雜合性丟失是一種常用于檢測等位基因缺失的方法。Yuan等［1］發現肝癌組織和細胞系的染色體8p21.3～22.0區域存在雜合性丟失，并據此命名了DLC-1。隨后在結直腸癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌等腫瘤中也發現DLC-1基因不同程度的雜合性丟失。

2.2 點突變 DLC-1基因的序列點突變在結腸癌中較為罕見。Wilson等［18］用基于PCR的單鏈構象多肽性分析（SSCPPCR）技術研究發現，結直腸癌DLC-1基因只存在個別位點的錯義突變，所占比例非常小。通過突變分析發現結直腸癌DLC-1含有許多單核苷酸多態性（SNP）位點，而這些SNP位點中已有部分被證實與腫瘤發生的易感性無關。其他腫瘤中DLC-1基因的點突變也極為罕見，提示點突變不是DLC-l失活的主要機制。

2.3 啟動子區域甲基化 基因調控表遺傳學說認為，基因序列啟動子區域高度甲基化可使抑癌基因轉錄沉默，從而促進細胞惡性轉化。目前的研究顯示，結腸癌DLC-1的失活主要與啟動子甲基化有關。Wilson等［18］研究發現DLC-1基因在正常組織中廣泛表達，而在結直腸癌等多種腫瘤中呈現表達缺失或表達下調，而且這種異常表達與啟動子區異常甲基化有關。Yuan和Durkin［16］采用Southern雜交技術對結腸癌等腫瘤細胞系的啟動子區域甲基化狀態進行研究，發現所有的腫瘤細胞系啟動子區域都有不同程度的甲基化，顯示DLC-1基因可通過啟動子區域甲基化而發生失活。金月玲等［19］應用甲基化特異性PCR（MSP）方法和亞硫酸氫鹽修飾DNA測序檢測3種結腸癌細胞株DLC-1啟動子區域甲基化狀態，發現CaCo-2和LoVo細胞中DLC-1mRNA呈陽性表達，啟動子區域未發生甲基化，HT-29細胞中DLC-1mRNA表達呈陰性，啟動子區域高度甲基化；經5氮雜胞苷藥物干預后，HT-29細胞的DLC-l基因表達明顯增強。提示結腸癌細胞株 HT-29中DLC-1基因表達沉默與啟動子區高甲基化狀態有關。伍健等［20］在對不表達DLC-1mRNA的結直腸癌細胞系SW480、HT-29細胞的研究中也有類似的結論。給予去甲基化藥物5′－氮雜2′-脫氧胞嘧啶后能使細胞系恢復DLC-1mRNA的表達，觀察發現細胞的增殖力、克隆形成能力、細胞侵襲能力都明顯下降。

3 DLC-1基因在結腸癌發生、發展中的作用

目前研究表明DLC-1基因對結腸癌有抑制作用，是結腸癌的一種抑制基因。Jin等［21］篩選了DLC-1陽性表達的人結腸癌LoVo細胞株作為靶細胞，應用RNAi技術沉默LoVo細胞株DLC-1陽性的表達，結果觀察到干擾后LoVo細胞的增殖曲線比干擾前上升，并隨著時間的增加而逐漸明顯；細胞侵襲實驗結果亦顯示，DLC-1基因抑制后LoVo細胞侵襲到基底膜的能力明顯增強；通過RNAi抑制DLC-1的表達，促進LoVo細胞的增殖及侵襲，并引起細胞周期重新分布。商延芳等［22］同樣運用RNAi技術沉默LoVo細胞株DLC-1基因的表達，得出DLC-1的表達水平與結腸癌細胞侵襲轉、移有關。田小強等［23］在對結腸癌細胞SW480的研究中得出DLC-1基因可影響結腸癌細胞SW480的增殖能力和侵襲力，并使結腸癌細胞SW480細胞周期阻滯于G2期。Wu等［24］發現，轉染DLC-1基因引起人結腸癌HT-29細胞凋亡增加，細胞周期停滯于S期，細胞的增殖和轉移能力受到明顯抑制，并且這種抑制作用可能是通過對Cyclin D1、p21表達的調控來實現。吳鵬等［25］將DLC-1基因及RhoGAP結構域缺失的△DLC-1亞克隆至結腸癌HT-29細胞株，結果轉染成功后，全長DLC-1基因轉染組與野生型及空載組相比，細胞增殖能力下降，侵襲能力減弱，細胞周期G1期阻滯并誘導凋亡，而△DLC-1亞克隆轉染組對細胞增殖、侵襲及細胞周期均無明顯影響；證明DLC-1基因可能是通過其內在的RhoGAP結構域抑制人結腸癌細胞HT-29的增殖和侵襲。

4 展 望

DLC-1是一個與結腸癌發生發展關系密切的抑癌基因。DLC-1基因在結腸癌的發生過程中常發生啟動子區域甲基化或表達缺失可能是腫瘤發生的早期事件。因此DLC-1啟動子區域甲基化和基因表達異常可能成為結腸癌早發現、早預測、早治療的重要指標之一，并能為結腸癌治療療效的評估提供依據。

作為腫瘤抑制基因，全面掌握DLC-1附加結構域的功能、相互之間的作用，以及其上、下游靶基因信號通路的精確調節機制，都將對DLC-1相關腫瘤的預防和治療起決定性作用。DLC-1基因以及其上、下游信號通路相關因子可成為預測和診斷腫瘤的生物標記，并有望成為腫瘤治療的新靶點。隨著現代生物醫學技術的發展，DLC-1基因更多的生物學功能以及相關的信號通路將被揭示，從而為結腸癌的治療提供一條新的途徑。

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